维普资讯 http://www.cqvip.com ２００７年第６５卷 第１６期，１６９３￣１７０１ 化学学报 ＡＣＴＡ ＣＨＩＭＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ 、ｂ１．６５．２０ｏ７ Ｎｏ．１６．１６９３～ｌ７０ｌ 研究论文 酮醇酸还原异构酶（ＫＡＲ１）与其抑制剂间相互作用的分子模拟研究 陈沛全 刘幸海 ａ，ｂ 李正名 ｄ 孙宏伟 赖城明 天津３０００７１） 天津３０００７１） 王宝雷 （。南开大学元素有机化学研究所（ 南开大学化学系（ 南开大学元素有机化学国家重点实验室（ 南开大学科学计算研究所天津３０００７１） 天津３０００７１） 摘要采用ＭＣＣＥ，Ａｕｔｏｄｏｃｋ及密度泛函方法对酮醇酸还原异构酶（ＫＡＲＩ）与其抑制剂间相互作用进行了研究．计算结 果表明，ＫＡＲｌ活性位点中的Ｍｇ 在活性位点残基的离子化状态、活性位点的静电性质以及与抑制剂结合等方面起重 要的作用；同时，抑制剂在结合方式、前线轨道布居及静电势等方面与酶促反应中间体（ＨＯＩＶ）具有一定程度的相似性： 可电离的羧基是当前发现的靶向ＫＡＲｌ抑制剂一个重要的结构特征，进一步推广可认为潜在的抑制剂应该拥有可电离 成负电荷的功能团．在药物设计中考虑到以上结论，将有利于发现和改造靶向ＫＡＲＩ的抑制剂． 关键词酮醇酸还原异构酶（ＫＡＲ１）；抑ＮＮ；Ｐｏｓｓｉｏｎ—Ｂｏｌｔｚｍａｎｎ方程；分子对接：密度泛函理论 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｕｄｉｅｓ ｏｆ Ｉ ｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｋｅｔｏ１．ａｃｉｄ Ｒｅ． ｄｕｃｔｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ＣＨＥＮ．Ｐｅｉ—Ｑｕａｎ“， ＬＩＵ．Ｘｉｎｇ—Ｈａｉ“， ＬＩ．Ｚｈｅｎｇ—Ｍｉｎｇ术，“， ， ＳＵＮ．Ｈｏｎｇ—Ｗｅｉ。， ＬＡＩ．Ｃｈｅｎｇ—Ｍｉｎｇ ，。 ＷＡＮＧ，Ｂａｏ—Ｌｅｉ“＇ （。Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆＥｌｅｍｅｎｔｏ－Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｎａｎｋａｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ ３０００７１） （ Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆＥｌｅｍｅｎｔｏ－Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｙ，Ｎａｎｋｒａｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｙｔ，Ｔｉａｎｊｉｎ ３０００７１） （ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｙ，Ｎａｎｋｒａｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｙ，Ｔｉｔａｎｊｉｎ ３０００７１） （ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆＳｃｉｅｎｔｉｉｆｃ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，Ｎａｎｋａｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｙｔ，ｌｉａｎｊｉｎ ３０００７１） Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｋｅｔｏｌ—ａｃｉｄ ｒｅｄｕｃｔｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ ｆＫＡＲＩ１ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ａ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｓｕｃｈ ａｓ ＭＣＣＥ，Ａｕｔｏｄｏｃｋ ａｎｄ ｄｅｎｓｉｔｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｔｈｅｏｒｙ．Ｔｈｅ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ Ｍｇ ｉｏｎｓ ａｔ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ ｐｌａｙｅｄ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｉｏｎｉ— ． ｚａｔｉｏｎ ｓｔａｔｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ａｔ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ，ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ ａｎｄ ｌｉｇａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇＴｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｒｅ ｓｉｍｉｌａｒ ｉｎ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅ ｏｆ ＫＡＲＩ．ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｆｒｏｎｔｉｅｒ ｏｒｂｉｔａｌｓ ａｎｄ ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ａｌｓｏ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｔｈｅ ｉｏｎｉｚａｂｌｅ ｃａｒｂｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐｓ ａｓ ａ ｋｅｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｆｅａｔｕｒｅ ｆｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＫＡＲＩ．Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｉｓ ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ，ｉｔ ｗａｓ ｆｕｒｔｈｅｒ ｄｅｄｕｃｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｐｒｏｂａ— ｂｌｙ ｈａｄ ａｎ ｉｏｎｉｚａｂｌｅ ｇｒｏｕｐ ｔｈａｔ ｃｏｕｌｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｐｒｏｔｏｎ ａｎｄ ｂｅ ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ｃｈａｒｇｅｄ．Ｔｈｅ ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ ｏｆ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔｕｄｙ ｗｉｌｌ ｐｒｏｖｉｄｅ ｖａｌｕａｂｌｅ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ｆｕｒｔｈｅｒ ｐｏｔｅｎｔ ＫＡＲＩ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｐｒｉｏｒ ｔｏ ｔｈｅｉｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ ｋｅｔｏｌ—ａｃｉｄ ｒｅｄｕｃｔｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ（ＫＡＲＩ）：ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ；Ｐｏｓｓｉｏｎ—Ｂｏｌｔｚｍａｎｎ ｅｑｕａｔｉｏｎ；ｍｏｌｅｃｕｌｒ ｄｏｃｋ—ａ ｉｎｇ；ｄｅｎｓｉｔｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｔｈｅｏｒｙ Ｅ．ｍａｉｌ：ｎｋｚｍｌ＠ｎｋ．ｓｉｎａ．ｎｅｔ Ｒｅｃｅｉｖｅｄ Ｊａｎｕａｒｙ ２１，２００７；ｒｅｖｉｓｅｄ Ｍａｒｃｈ １９，２００７；ａｃｃｅｐｔｅｄ Ａｐｒｉｌ ２５，２００７． 国家９７３计￣ｌＪ（Ｎｏ．２００３ＣＢ１１４４０６）、国家自然科学基金重点项目（Ｎｏ．２０４３２０１０）及天津市科委高性能计算（Ｎｏ．０４３１８５１１１－５）资助项目 维普资讯 http://www.cqvip.com １６９４ 化学学报 Ｖｏ１．６５，２００７ 乙酰乳酸合成酶（Ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＡＬＳ，ＥＣ ４．１．３．１８）、酮醇酸还原异构酶（Ｋｅｔｏｌ—ａｃｉｄ ｒｅｄｕｃｔｏｉｓｏｍ— ｅｒａｓｅ，ＫＡＲｌ，ＥＣ １．１．１．８６）均是植物和微生物中支链氨基 酸生物合成过程中的关键酶【Ｊ０１．通过抑制植物体内这 些酶的活性，使植物体内支链氨基酸的生物合成受阻， 可以达到除草的目的．目前靶向支链氨基酸生物合成途 径的除草剂主要有磺酰脲类［３ 和咪唑啉酮类【４ 除草剂等， 研究结果表明这些除草剂的靶标分子均为乙酰乳酸合 成酶．然而，当前并没有靶向酮醇酸还原异构酶的商品 化除草剂面世，因此靶向ＫＡＲｌ抑制剂的设计工作具有 广阔的研究空间． 迄今为止，所报道的靶向ＫＡＲＩ抑制剂种类和数量 稀少．这些抑制剂从抑制作用类型上可以分为两类：（１） 非竞争性抑制剂，如１，２，３一噻二唑类化合物【５ ；（２）竞争性 抑制剂。如ＩｐＯＨＡＩ刚，ＨＯＥ７０４ｔ ，ＣＰＤＩ ．这些化合物在 抑制ＫＡＲｌ活性上（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）具有很好的效果，但在活体 测试（ｉｎ ｖｉｖｏ）结果却不理想，因而研究如何改造这些类 型抑制剂及发现其它类型除草剂具有一定的理论和现 实意义．其中ＫＡＲｌ竞争性抑制剂（Ｉｐ０ＨＡ，ＨＯＥ７０４， ＣＰＤ）是当前人们关注得最多的，这些抑制剂结构基本 上都与反应中间体『３一羟基一２一氧２一异戊酸（ＨＯＩＶ）或３一羟 基一２一甲基一２一氧一２一戊酸（ＨＭＯＶ）］类似，为过渡态类似物 抑制剂（图１）．ＣＰＤ．Ｅｔ是我们经过结构改造后具有一定 的除草活性的化合物，抑制ＫＡＲｌ性能较ＣＰＤ好． Ｏ 。。 Ｈ ＣＨ３ 谗Ｈ。 ＣＨ３ ＨＯＥ ７０４ ＩｐＯＨＡ ％ｏｏ一 。。醛 ＣＰＤ Ｅｔ—ＣＰＤ ＨＯＩＶ 图１ ＫＡＲｌ竞争性抑制剂及其反应中间体 Ｆｉｇｕｒｅ １ Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ ｄｉａｇｒａｍ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（￣ｐＯｎＡ，ＨＯＥ ７０４，ＣＰＤ，ＣＰＤ－Ｅｔ）ａｎｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒ— ｍｅｄｉａｔｅ（ＨＯＩＶ） １ ９９７和２０００年，植物ＫＡＲｌ—ＮＡＤＰＨ（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｒｅｄｕｃｅｄ ｆｏｒｍ）一Ｍｇ 一 ＩｐＯＨＡ［ 及ＫＡＲｌ一［（ｐｈｏｓｐｈｏ）一ＡＤＰ—ｒｉｂｏｓｅ］一Ｍｎ 一ＤＭＶＩ 。】 的晶体结构相继被解析和报道，这为人们更好地理解抑 制剂与酶的相互作用提供了方便，同时也为基于酶结构 的除草剂设计提供了新的机遇． 我们曾在ＫＡＲＩ复合物晶体结构的基础上进行计算 机辅助设计¨１，１２１，通过虚拟筛选方法找到了一些结构新 颖的ＫＡＲｌ抑制剂．但是在过去的研究中，我们并没有 考虑辅助因子ＮＡＤＰＨ和Ｍｇ 的作用，因而虚拟筛选的 结果不够理想．本研究工作是在前文…，他 工作的基础 上，考虑到活性位点ＮＡＤＰＨ及Ｍｇ 的作用，应用多种 分子模拟方法对ＫＡＲｌ与其竞争性抑制剂（ＩｐＯＨＡ， ＨＯＥ７０４，ＣＰＤ及ＣＰＤ—Ｅｔ）间相互作用进行详细的理论分 析（为了便于比较，我们同时还研究了ＫＡＲｌ与其反应中 间体ＨＯＩＶ间的相互作用），探讨这些抑制剂与靶酶之 间的作用方式及一些共同的作用因素，从而为ＫＡＲｌ抑 制剂的进一步改造和新类型抑制剂的发现提供理论基 础及线索．本研究工作所获得的理论信息将更好地指导 进一步的基于靶酶结构的计算机虚拟筛选研究． １材料与方法 本文采用的ＫＡＲｌ—ＮＡＤＰＨ—Ｍｇ 一ＩｐＯＨＡ结构（ＰＢＤ 号：１ＹＶＥ）从Ｂｒｏｏｋｈｅａｖｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａｂａｎｋ（ＰＤＢ）数据 库中获取。除ＩｐＯＨＡ来自晶体结构外，其它类型抑制剂 的初始结构均为人工搭建．１ＹＶＥ是一个双二聚体，即 有四个单体，分别为Ｉ，Ｊ，Ｋ，Ｌ四条链．定点突变实验表 明【Ｊ ，酶的单体也可具有相应的活性，因此为了处理方 便，我们主要选取Ｉ链作为研究对象．计算过程以 ＡＫＲｌ—ＮＡＤＰＨ Ｍｇ 部分作为受体（且含有与Ｍｇ 相互 作用的５分子晶体水），不同的抑制剂为配体．所有计算 工作在“南开之星”超级计算集群及自组建Ｌｉｎｕｘ计算 集群上完成的． １．１ 酶及抑制剂可电离基团质子化状态的预测 酶及抑制剂可电离基团的质子化状态预测使用 ＭＣＣＥ（Ｍｕｌｔｉ—Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓ）软 件包【Ｊ训，如无特别说明，参数均使用程序的默认参数． 该程序是通过结合分子力学及基于Ｐｏｓｓｉｏｎ—Ｂｏｌｔｚｍａｎｎ 方程的静电势计算体系不同状态下的自由能（可考虑蛋 白质侧链的构象变化），然后通过Ｍｏｎｔｅ Ｃａｒｌｏ抽样方法 计算体系不同ｐＨ值下可电离基团的质子化状态及其 ｐＫａ值．在具体计算中，以上述的蛋白质复合物结构为 基础，蛋白质内部的介电常数为８，环境的介电常数取 ８０，同时为减少计算量，只考虑抑制剂ＩｐＯＨＡ及其周围 ０．６ ｎｍ范围内残基的侧链构象变化．对于体系中的 ＮＡＤＰＨ辅助因子，只考虑其电荷一３时的质子化状态， 对于抑制剂ＩｐＯＨＡ，溶液状态的ｐＫａ值通过Ｍａｒｖｉｎ程 序［１５１预测（ｐ ＝２．７９），然后根据此数据来考虑其电荷为 １及０时两种不同的质子化状态：ＮＡＤＰＨ及ＩｐＯＨＡ 的原子电荷计算采用ＱｕａｃＰＡＣ软件包【ｌ州中的ＭＭＦＦ９４ 力场电荷． 维普资讯 http://www.cqvip.com Ｎｏ．１６ 陈沛全等：酮醇酸还原异构酶（ＫＡＲ１）与其抑制剂间相互作用的分子模拟研究 １６９５ １．２抑制剂与酶相互作用的分子对接研究 分子对接采用Ａｕｔｏｄｏｃｋ ３．０５程序¨ 进行．对接选 用的受体格点盒子大小为２．２５ ｎｍ×２．２５ ｎｍ×２．２５ ｎｍ （６０点×６０点×６０点），格点间距０．３７５ ｎｍ，格点盒子中 心位于抑制剂ＩｐＯＨＡ的中心．计算过程中，可电离基团 的质子状态基于上述的ＭＣＣＥ计算，受体中非极化氢 原子的位置由ＭＣＣＥ及ＡｕｔｏｄｏｃｋＴｏｏｌｓ软件包处理得 到；电荷方面，蛋白质部分通过ＡｕｔｏｄｏｃｋＴｏｏｌｓ软件 包ｌｌ 加载ｋｏｌｌｍａｎ电荷，ＮＡＤＰＨ辅助因子加载ＭＭＦＦ９４ 电荷，Ｍｇ 部分的电荷为＋２，抑制剂（ＩｐＯＨＡ，ＨＯＥ７０４， ＣＰＤ，ＣＰＤ—Ｅｔ）以及反应中间体（ＨＯＩＶ）的原子电荷通过 ＲＥＳＰ方法计算得到．受体部分中，ＮＡＤＰＨ及Ｍｇ 的溶 剂化参数分别参照ＡｕｔｏｄｏｃｋＴｏｏｌｓ中相应的核酸部分和 默认参数获得．Ｍｇ 的范德华参数采用Ａｍｂｅｒ力场参数． 氢键和范德华相互作用分别采用１２—１０和１２—６ Ｌｅｎ— ｎａｒｄ—Ｊｏｎｅｓ参数形式．运用Ｌａｍａｒｃ￣ａｎ遗传算法（ＬＧＡ）． 将局部能量搜索与遗传算法相结合，以半经验势函数作 为能量打分函数，对小分子构象和位置进行全局搜索， 遗传算法的种群数为１５０，ｇａ＿ｎｕｍ＿ｅｖａｌｓ设置为１．５× １０ ．进行１００次对接，选择测试构象与初始构象的 位置均方根偏差ＲＭＳＤ＜０．１０ ｎｍ作为评价标准进行聚 类，其它参数为程序的默认值． １．３量子化学计算研究 量子化学计算使用Ｇａｕｓｓｉａｎ ０３软件包ｌ】 ．抑制剂 （ＩｐＯＨＡ，ＨＯＥ７０４，ＣＰＤ，ＣＰＤ—Ｅｔ）及反应中间体（ＨＯＩＶ） 的初始构型为上述分子对接计算中的最低对接能量构 象．为使抑制剂及反应中间体保持与靶酶结合时的构 型，采用密度泛函Ｂ３ＬＹＰ方法在６—３１＋＋Ｇ料水平下对 抑制剂（ＩｐＯＨＡ，ＨＯＥ７０４，ＣＰＤ，ＣＰＤ—Ｅｔ）￥Ｈ反应中间体 （ＨＯＩＶ）进行局部优化计算，即在优化过程中固定分子 中的二面角为其初始值，对分子的其它自由度进行优化 计算．收敛指标采用Ｇａｕｓｓｉａｎ ０３的缺省值．在此优化结 构的基础上．获得了这些抑制剂及反应中间体的分子轨 道及静电势信息． ２结果与讨论 ２．１ 活性位点及抑制剂可电离基团离子化状态 蛋白质中往往具有许多可电离的侧链基团，如Ａｓｐ 和Ｇｌｕ中的羧基、Ｌｙｓ和Ａｒｇ中的氨基和胍基．这些基 团离子化状态对于蛋白质的结构稳定性、水溶性、催化 活性以及蛋白质一配体间相互作用等方面起着重要的作 用．决定这些基团的电离状态是其ｐＫａ值．然而由于实 验上的困难，目前还没有关于ＫＡＲＩ中可电离基团的 ｐＫａ测定的报道． 晶体结构表明 】，ＫＡＲＩ酶活性位点（图２）大部分都 是由极性氨基酸残基组成的，其中Ｇｌｕ３１１，Ａｓｐ３１５， Ｇｌｕ３１９，Ｇｌｕ４９２和Ｇｌｕ４９６是酸性可电离氨基酸残基， Ｌｙｓ２５２和Ｈｉｓ２２６是碱性可电离氨基酸残基，Ｓｅｒ５１８是极 性不可电离残基．同时，由于ＩｐＯＨＡ分子中具有羧基， 因此抑制剂ＩｐＯＨＡ也是可电离的．这些可电离基团由 于包埋于ＫＡＲＩ的活性位点内部而难以与溶剂发生作用 以稳定其电离状态（损失大量的溶剂化能），且这些可电 离基团在空间上由于彼此靠近而产生非常强的静电相 互作用（包括静电吸引和静电排斥作用），因此活性位点 可电离残基及抑制剂ＩｐＯＨＡ的ｐＫａ值及离子化状态往 往容易表现出异于溶液环境中的ｐＫａ及离子化状态．因 此，通过计算方法预测活性位点残基和抑制剂的ｐＫａ值 及离子化状态对于了解ＫＡＲＩ酶与抑制剂间的相互作用 非常重要．表１列出了通过ＭＣＣＥ计算得到的活性位点 残基及抑制剂的ｐＫａ值、离子化状态以及其ＭＦＥ能量 分析结果． 图２ ＫＡＲｌ酶活性位点示意图 Ｆｉｇｕｒｅ ２ Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ＫＡＲｌ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ 从表１可见．活性位点残基Ｈｉｓ２２６的ｐＫａ为１．７２， 在ｐＨ＝８（ＫＡＲＩ酶最佳活性ｐＨ值）时电荷为０，表现为 中性状态．分析此时可电离Ｈ原子在Ｎ 和Ｎ 上的分布 情况显示，可电离Ｈ原子在Ｎ 上的布居为０．８７１，在Ｎ 上的布居为０．１２９．晶体结构分析表明，Ｈ原子在Ｎ 时可 以与临近的Ｇｌｕ３１ １有效地形成氢键．Ｌｙｓ２５２的ｐＫａ计算 值为１３．６８，在ｐＨ＝８时电荷为１，即其氨基为ＮＨ 状 态．晶体结构分析表明，虽然Ｌｙｓ２５２的电离状态与活性 位点的Ｍｇ 离子存在着静电排斥作用，但是由于 Ｌｙｓ２５２位于一个由Ａｓｐ２０２，Ｇｌｕ３１１，Ａｓｐ３１５，Ｇｌｕ３１９以 及ＮＡＤＰＨ（一３）组成区域的中心，其与这个中心的静电 维普资讯 http://www.cqvip.com ｌ６９６ 化学学报 Ｖｂ１．６５．２００７ 表１活性位点可电离氨基酸及抑制剂ＩｐＯＨＡ的ｐＫａ及离子化状态以及其ＭＦＥ能量分析 Ｔａｂｌｅ １ ｐ ｖａｌｕｅｓ，ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｓｔａｔｅｓ ａｎｄ ＭＦＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｏｎｉｚａｂｌｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ａｎｄ ＩｐＯＨＡ ｉｎ ＫＡＲｌ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ＭＣＣＥ ｃａｌｃｕｌａ— ｔｌＯｎｓ 。Ｔｈｅ ｖａｌｕｅｓ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｔｈｅ ｃｈ￣ｇｅ ｓｔａｔｅ ａｔ ｐＨ ８，ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｐＨ ｖａｌｕｅ ｆｏｒ ｃａｔａｌｙｓｉｓ． Ｔｈｅ Ｄｓｏｌ，ｐＨ＆ｐＫｏ ａｎｄ ｒｅｓｉｄｕｅ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｏｆ ｌｏｓｓ ｏｆ ｓｏｌｖａｔｉｏｎ ｅｎｅｒｇｉｅｓ，ｐＨ ｅｆｆｅｃｔ，ａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｅｎｅｒｇｉｅｓ ｏｆ ｏｔｈｅｒ ｐａｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ ｔｈｅ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｅｎｅｒｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｓｉｄｕｅ ａｔ ｐＨ＝８（ｉｎ ｐＨ ｕｎｉｔ，１ ｐＨ ｕｎｉｔ＝５．７０ ｋＪ。 ｍｏｌ ），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． 吸引作用、氢键作用将有利于Ｌｙｓ２５２以其离子化状态 存在．计算结果表明，活性位点酸性残基Ｇｌｕ３１１， 虑其它因素，溶剂化能的损失将导致这些残基及抑制剂 的ｐ 值升高了相应的ｐＨ单位，使活性位点的酸性残 基及抑制剂的ｐ 值＞８，即在ｐＨ＝８时这些残基以非 Ａｓｐ３１５，Ｇｌｕ３１９，Ｇｌｕ４９２及抑制剂ＩｐＯＨＡ的ｐＫ．计算值 均＜０，Ｇｌｕ４９６的ｐＫａ计算值为３．５０，电荷均为０，即在 ｐＨ＝８时这些基团上羧基上的Ｈ原子１００％电离．活性 电离状态（ＣＯＯＨ）存在．但是ＭＦＥ分析结果表明，活性 位点残基及抑制剂的离子化能分别为２１．９２，一２１．７１， 一位点酸性残基及抑制剂的ｐＫａ计算值远低于相应残基在 水溶液中的ｐＫａ（ｍｏｄｅ１）值（Ａｓｐ＝４．０，Ｇｌｕ＝４．３，ＩｐＯＨＡ＝ ２．７９），表明了这些可电离基团与必然与酶中其它部分 的残基、辅助因子等发生较强的相互作用．对复合物的 晶体结构进一步分析表明，活性中心的两个Ｍｇ 与这 些酸性基团的电离形式（ｃｏｏ）可存在着较强的静电相 互作用，这种静电相互作用将促进和稳定活性位点酸性 残基及抑制剂的电离． ２１．３４，一５７．６１，一４５．０６，一２３．５１，一２２．０５，一５８．３２ ｋＪ・ｍｏｌ～，即除Ｈｉｓ２２６外，活性位点残基及抑制剂以离 子化状态存在．进一步的ＭＦＥ分析表明，ｐＨ与ｐＫｏ（溶 液状态下的ｐＫａ值）差值（ｐＨ＆ｐＫｏ）￣Ｗ体系其它部分与该 残基的相互作用￣（Ｒｅｓｉｄｕｅ）对溶剂化能的影响较大．表 ２表明，体系其它部分对残基的相互作用能均＜０，即体 系其它部分对该残基的离子化状态起稳定作用．对体系 各个部分的相互作用的ＭＦＥ细致分析表明，活性位点 酸性残基（Ｇｌｕ３１ １，Ａｓｐ３１５，Ｇｌｕ３１９，Ｇｌｕ４９２，Ｇｌｕ４９６）及抑 为进一步理解活性位点残基及抑制剂的ｐＫａ及离子 化状态，应用平均场理论（ＭＦＥ）对活性位点残基及抑制 剂的离子化能进一步分析（表１）．计算结果表明，活性位 点残基（Ｈｉｓ２２６，Ｌｙｓ２５２，Ｇｌｕ３１ １，Ａｓｐ３ｌ５，Ｇｌｕ３１９， 制剂（Ｉｐ０ＨＡ）与两个Ｍｇ 问的相互作用能均＜一ｌ２ ｐＨ 单位，即Ｍｇ 与这些酸性基团ＩＮＣＨ互作用使这些基团 的ｐ 降低多于１２个ｐＨ单位，从而使这些基团的ｐ 值基本上都是＜０，在ｐＨ＝８时这些残基及抑制剂以其 离子化状态存在． 通过以上的分析可见，活性位点Ｍｇ 对于决定活 性位点残基尤其是酸性残基的ｐ 值及离子化状态起着 Ｇｌｕ４９２，Ｇｌｕ４９６）及抑制剂（Ｉｐ０ＨＡ）的去溶剂化能分别为 ２．７１，５．５３，４．９５，５．５１，５．０７，４．２８，５．０１，５．２３ ｐＨ单位，表 明活性位点残基及抑制剂被包埋在蛋白质的内部，不能 很好地与溶剂发生相互作用以稳定其离子形式．若不考 表２不同抑制剂及反应中间体的分子对接结果。 Ｔａｂｌｅ ２ Ｄｏｃｋｉｎｇ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｎｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ Ｌｉｇａｎｄ Ｎｏ ｏｆ ｃｌｕｓｔｅｒｓ Ｒａｎｋ ｏｆ ｃｌｕｓｔｅｒ Ｍｅｍ ｓｉｎ山ｓｔｅｒｓｏ ｃ ｋｅｄ ｅ ｎｅ 。 Ｖ。ｗ ｏｍｏｌ－Ｉ ｌｅｔｒｏｓ ｔａｔｉ ｃ 。表中能量数据为不同构象类中对接能最低构象的能量 维普资讯 http://www.cqvip.com Ｎｏ．１６ 陈沛全等：酮醇酸还原异构酶（ＫＡＲ１）与其抑制剂间相互作用的分子模拟研究 １６９７ 非常重要的作用．Ｍｇ 促进了活性位点酸性残基 （Ｇｌｕ３１１，Ａｓｐ３１５，Ｇｌｕ３１９，Ｇｌｕ４９２，Ｇｌｕ４９６）及抑制剂 （ＩｐＯＨＡ）的电离，且由于电离状态下Ｍｇ 与酸性残基及 抑制剂问存在着较强的静电相互作用，从而起到了桥接 活性位点残基与抑制剂的作用．从目前发现的靶向 ＫＡＲＩ抑制剂的结构来看，它们基本上都具有一个酸性 可电离残基，当这些抑制剂结合到ＫＡＲＩ的活性位点， Ｍｇ。 将促进其电离以增强其与Ｍｇ 间的静电吸引作用， 因而在ｐＨ＝８时这些抑制剂将以离子化状态结合到酶 的活性中心．因此，Ｍｇ 在抑制剂与靶酶的结合过程中 起重要的作用．考虑到Ｍｇ 的作用，可以预测潜在的 抑制剂可能是一种可电离的酸性物质，这将有助于发现 新的抑制剂类型． 需要指出的是，在ＭＣＣＥ计算中不仅可以预测活 性位点可电离残基的离子化状态，还可以预测蛋白质其 它部分可电离残基的离子化状态及其它极化Ｈ原子的 位置，为以下的分子对接（Ａｕｔｏｄｏｃｋ）提供一个可靠的受 体模型． ２．２ 酶与｝叩制剂（ＩｐＯＨＡ，ＨＯＥ７０４，ＣＰＤ，ＣＰＤ—Ｅｔ）及 反应中间体（ＨＯＩＶ）的作用方式 １ ＹＶＥ （菠菜ＫＡＲＩ．ＮＡＤＰＨ．Ｍｇ ．ＩｐＯＨＡ）及 １ＱＭＧ［１ｏ１（菠菜ＫＡＲ１．［（ｐｈｏｓｐｈｏ）．ＡＤＰ．ｒｉｂｏｓｅ］．Ｍｎ ． ＤＭＶ）是目前仅有的两个基于植物ＫＡＲＩ结构的晶体． 为验证Ａｕｔｏｄｏｃｋ在预测菠菜ＫＡＲＩ复合物结构的适用 性，首先对ＩｐＯＨＡ与受体ＫＡＲＩ．ＮＡＤＰ．２Ｍｇ２＋－５Ｈ２０的 对接进行研究．在分子对接过程中，受体ＫＡＲ１． ＮＡＤＰＨ．２Ｍｇ２＋＿５Ｈ２Ｏ中极化氢原子的位置是基于上述 ＭＣＣＥ计算得到，并考虑到受体和配体中可电离基团的 质子化状态，ＩｐＯＨＡ以其离子化形式对接到受体ＫＡＲ１． ＮＡＤＰＨ．２Ｍｇ２＋＿５Ｈ２Ｏ中．表２给出了ＩｐＯＨＡ对接的结 果．在ＩｐＯＨＡ的１００次不同对接中，１００个对接构象都 收敛在同一类构象簇中，抑制剂和配体问平均对接能为 ５３．５６ ｋＪ・ｍｏｌ～，对接构象相对于晶体结构的ＲＭＳＤ 为０．０３２～０．０７２ ｎｍ，其中最低能量构象的对接能为 ５４－３１ ｋＪｏｍｏｌ，相对于晶体结构ＲＭＳＤ为０．０４８ ｎｍ． 图３ａ给出了最佳对接能构象与酶活性位点的作用方式 图，为了便于比较图中同时给出了ＩｐＯＨＡ的晶体结构 （黑色部分）．从对接过程中的ＲＭＳＤ和对接构象与晶体 构象的叠合图可见，基于Ｌａｍａｒｃｋｉａｎ遗传算法的 Ａｕｔｏｄｏｃｋ分子对接可以有效地重现抑制剂ＩｐＯＨＡ在 ＫＡＲＩ活性位点的晶体结构，为进一步应用Ａｕｔｏｄｏｃｋ预 测其它抑制剂和反应中间体与ＫＡＲＩ的作用方式奠定了 基础． 由于目前尚没有关于其它抑制剂与植物ＫＡＲＩ的复 合物晶体结构的报道，因而应用分子对接方法预测其它 抑制剂与植物ＫＡＲＩ的作用方式就显得尤其重要．在应 用分子对接方法能很好地重现ＩｐＯＨＡ在晶体中的结构 的基础上，我们进一步应用Ａｕｔｏｄｏｃｋ预测其它抑制剂 与植物ＫＡＲＩ的作用方式．表２和图３给出了分子对接 的结果． 在ＨＯＥ７０４中，与羟基相连的碳原子是一个具有手 性的碳原子，因而ＨＯＥ７０４就具有 和 两种结构，分 别标记为ＨＯＥ７０４（Ｒ）和ＨＯＥ７０４（Ｓ）．聚类分析表明１００ 个ＨＯＥ７０４（Ｒ）对接构象可分为２簇，其中９５个对接构 象位于第１个簇中，该簇的最佳对接构象的对接能为 －４８．３３ ｋＪ・ｍｏｌ＿。；ＨＯＥ７０４（Ｓ）的对接构象同样可以分为 两类，其中第一类簇中具有９６个构象，最佳对接构象的 对接能为－－４８．０７ ｋＪ・ｍｏ１．图３ｂ和３ｃ给出了ＨＯＥ７０４ 两种不同构型与ＫＡＲＩ的最佳作用方式．从作用方式看 ＨＯＥ７０４（Ｒ）的作用方式与ＩｐＯＨＡ类似，ＨＯＥ７０４（Ｒ）上羧 基上的一个Ｏ原子与ＯＨ基团上的０原子结合到Ｍｇｌ 上，而ＯＨ基团上的０原子与Ｏ＝Ｐ（ＣＨ３）２上的０原子 结合到Ｍｇ２上，且羧基与Ｓｅｒ５１８形成２个氢键（图３ｂ）； 而ＨＯＥ７０４（ 与ＨＯＥ７０４（Ｒ）相比就有所不同，它是以羧 基上两个Ｏ原子结合到Ｍｇｌ上，以羧基的其中一个Ｏ 和Ｏ＝Ｐ（ＣＨ３）２上的０结合到Ｍｇ２上，而ＯＨ基团上的 Ｏ不再与Ｍｇ 直接发生作用（图３ｃ）．从对接能上看 （一４８．３３ ＶＳ一４８．０７ ｋＪｏｍｏｌ ），两种不同构型的 ＨＯＥ７０４与ＫＡＲＩ结合程度相当． ＣＰＤ与受体ＫＡＲＩ．ＮＡＤＰＨ．２Ｍｇ２＋＿５Ｈ２Ｏ的对接结 果表明，１００次的对接构象可分为两簇，其中第一 簇有６１个构象，最佳对接构象对接能为一５３．Ｏ９ ｋＪ・ ｍｏｌ ；第二簇有３９个构象，最佳对接构象对接能为 －５１．８８ ｋＪ・ｍｏｌ～，结合程度两者相当．在结合方式上， 第一种作用方式是两个羧基各提供一个０原子与Ｍｇｌ 结合，其中一个羧基的两个０原子与Ｍｇ２结合，且其中 一个羧基与Ｓｅｒ５ １８形成氢键（图３ｄ）；第二种作用方式两 个羧基各提供一个Ｏ原子与活性位点的Ｍｇ 结合，其 中一个羧基与Ｓｅｒ５１８形成氢键（图３ｅ）． ＣＰＤ．Ｅｔ是一个我们通过结构优化得到的ＫＡＲＩ抑 制剂，水稻ＫＡＲｌ水平的抑制性测试表明其效果较ＣＰＤ 好．对接结果表明，ＣＰＤ—Ｅｔ的１００次对接可分为４簇，其 中第１和第２簇所占的比率较大，构象数分别为６０和 ３５个，最佳对接构象（图３ｆ和３ｇ）的对接能分别为 －４３．７３和－－４４．３０ ｋＪ・ｍｏｌ～．从对接能上看，ＣＰＤ．Ｅｔ与 靶酶ＫＡＲＩ的结合程度不如ＣＰＤ好．需要指出的是，目 前国内外ＫＡＲｌ体外抑制筛选模型还没有完善，正处于 探索阶段，我们生测所用ＫＡＲＩ的基因来自水稻，而分 子对接所用的生物大分子是菠菜ＫＡＲＩ，即所用ＫＡＲＩ 来源不同；且由于实际过程中酶与抑制剂的结合过程是 维普资讯 http://www.cqvip.com １６９８ 化学学报 Ｖｌ０１．６５．２００７ ｂ 羹 ｄ 羹 ９ ｇ ｈ 图３不同抑制剂及反应中间体与ＫＡＲＩ的作用方式图 Ｆｉｇｕｒｅ ３ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｎｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｔｏ ＫＡＲｌ 一个“诱导一契合”过程，蛋白质活性位点的残基会因结 分子对接将有助于了解酶促反应的具体过程以及如何 合不同的底物而发生构象变化，而分子对接中并没有考 虑到酶的柔性，这些因素可能导致计算结果和生测结果 存在误差．尽管如此，分子对接结果表明ＣＰＤ和 利用这些信息发现新的结构类型的抑制剂．聚类分析显 示，１００次ＨＯＩＶ的对接可分为３簇，其中第一簇的构象 数为９２，最佳对接构象的对接能为－－４６．８２ ｋＪ・ｍｏｌ－。，对 ＣＰＤ—Ｅｔ与靶酶ＫＡＲｌ抑制常数 都是在ｎｍｏｌ级别的， 即抑制剂与靶酶ＫＡＲｌ间的结合都是相当强的．图３ｆ给 出了ＣＰＤ—Ｅｔ第一簇的最佳作用方式，这个作用方式与 ＣＰＤ的第二种作用方式类似，羧基和酯基各提供一个Ｏ 原子与Ｍｇ 结合，且羧基的Ｏ原子与Ｓｅｒ５ｌ８上ＯＨ形 成氢键；图３ｇ给出了ＣＰＤ—Ｅｔ的第二种最佳作用方式， 其中一个羧基的两个Ｏ原子与Ｍｇｌ和Ｍｇ２分别结合， 酯基上的Ｏ原子不再与Ｍｇ 直接作用． ＨＯＩＶ是底物酶促反应过程中的中间物，对其进行 接方式见图３ｈ．可以看出，ＨＯＩＶ与靶酶的作用方式与 ＩｐＯＨＡ情况类似，通过分子中３个Ｏ原子结合到Ｍｇ 上形成复合物． 以上的分子对接讨论表明，中间体类似物抑制剂 （ＩｐＯＨＡ，ＨＯＥ７０４，ＣＰＤ，ＣＰＤ—Ｅｔ）与靶酶的作用方式和 反应中间体甚至底物与靶酶的作用方式类似，都是依靠 抑制剂上羧基及其它Ｏ原子的协同作用结合到靶酶活 性位点的Ｍｇ 上，阻碍了底物或中间体结合到酶上， 中断酶促反应的发生，达到抑制酶活性的目的．这些抑 维普资讯 http://www.cqvip.com Ｎｏ．１６ 陈沛全等：酮醇酸还原异构酶（ＫＡＲＩ）与其抑制剂间相互作用的分子模拟研究 １６９９ 制剂的抑制作用都是依赖于抑制Ｍｇ 的活性实现的， 因此Ｍｇ 在酶促反应及抑制过程中起重要作用．分析 子轨道ＨＯＭＯ和最低空分子轨道ＬＵＭＯ）及其附近的分 子轨道对分子的生物活性影响最大，ＨＯＭＯ附近的占据 轨道具有强供电子能力，而ＬＵＭＯ附近的空轨道具有 强接受电子的能力．从上述的分析可见，靶酶ＫＡＲＩ活 性中心由于活性位点两个Ｍｇ 的影响使活性位点的静 电势为正，即活性位点是一个缺电子的中心：而对于研 抑制剂与酶对接的作用能表明（表２），抑制剂或反应中 间体与酶之间的静电相互作用能与ＶＤＷ相互作用能相 当．考虑到酶的活性位点上基本都是酸性氨基酸残基 （Ａｓｐ和Ｇｌｕ），这些氨基酸的电离状态带有较多负电荷， 而抑制剂及底物结合到靶酶上基本上都是以其离子化 状态（带负电荷）结合到活性位点，因而抑制剂与这些残 基问基本上为静电排斥作用，抑制剂之所以能很好结合 到活性位点是因为抑制剂与Ｍｇ 问存在很强的静电吸 引作用，这进一步表明活性位点Ｍｇ 对于底物及抑制 剂的结合过程起着重要的作用．对静电相互作用能的进 一究的抑制剂和反应中间体来说，由于受活性位点Ｍｇ 的影响，结合到靶酶活性位点时往往是以其离子化状态 （带负电荷）存在，即这些配体是富电子的物质．因而， 当抑制剂及反应中问体结合到靶酶ＫＡＲＩ上时，电子的 流向是从配体的ＨＯＭＯ及其附近轨道流向受体的 ＬＵＭＯ及其附近的轨道．表３列出了抑制剂与反应中间 体的Ｈ０Ｍ０，ＨＯＭＯ－－１及ＨＯＭＯ－－２的轨道能量．从 步分析表明，抑制剂上羧基部分０原子及其它部分带 负电荷的Ｏ原子与Ｍｇ 问的静电作用是体系稳定的重 要因素，也就表明抑制剂上带负电荷的ＣＯＯ基团可能 是潜在ＫＡＲＩ抑制剂一个重要的结构特征，这与 Ｄｕｇｇｌｅｂｙ等Ｌ８】在研究ＣＰＤ抑制水稻ＫＡＲＩ实验报道中 指出羧基而非环丙烷基团是潜在ＫＡＲＩ抑制剂的关键结 构特征的结论一致．从ＭＣＣＥ和分子对接结果表明，酶 的活性位点是一个静电势为正的区域，因此靶向ＫＡＲＩ 的潜在抑制剂很可能存在着容易电离形成带负电荷的 基团．这一结论对于现有抑制剂的结构改造及新型抑制 剂的发现具有重要意义． 表３可见，除ＣＰＤ外不同抑制剂【Ｉｐ０ＨＡ，ＨＯＥ７０４（Ｒ）， ＨＯＥ７０４（Ｓ），ＣＰＤ—Ｅｔ］的ＨＯＭＯ，ＨＯＭＯ－－１及ＨＯＭＯ－－２ 轨道能量与反应中间体ＨＯＩＶ的能量相近，这可能是这 些抑制剂对ＫＡＲＩ产生抑制活性的分子基础． 图４给出了这些抑制剂及反应中间体的ＨＯＭＯ及 ＨＯＭＯ一１轨道，图５给出了抑制剂和反应中间体 （ＨＯＩＶ）在电子密度表面（ｉｓｏｖａｌｕｅ＝０．ｏ４）上的静电势图． 对比抑制剂与反应中间体的前线轨道（ＨＯＭＯ和ＨＯＭＯ－－ １）可见，抑制剂与反应中间体的Ｈ０ＭＯ及ＨＯＭＯ－－１ 在形状上存在一定的相似之处，前线轨道（ＨＯＭＯ和 ＨＯＭＯ一１）的主要布居在与受体结合的基团上，如羧 基、羟基及羰基上，且在羧基上的布居占主要，这进一 ２．３ ｇＰ￥０剂（ＩｐＯＨＡ，ＨＯＥ７０４，ＣＰＤ，ＣＰＤ－Ｅｔ）及反应 中间体（ＨＯＩＶ）的前线轨道及静电势 根据前线轨道理论，分子的前线轨道（最高占据分 表３不同抑制剂及反应中间体的ＨＯＭＯ，ＨＯＭＯ－－ｌ及ＨＯＭＯ－－２轨道能量 Ｔａｂｌｅ３ Ｅｎｅｒｇｉｅｓ ｏｆＨＯＭＯ，Ｈ０Ｍ０一ｌ ａｎｄＨＯＭＯ－－２ ｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｎｄ ｒｅａｃｔｉｏｎｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ（ａ，ｉ１．） 舔嗨 蛾瓤 ｐＯＨＡ：ＨＯＭＯ ＩｐＯＨＡ：ＨＯＭＯ一１ ＨＯＥＴ０４（Ｒ）：ＨＯＭＯ ＨＯＥ７０４（Ｒ）：ＨＯＭＯ一１ ＨＯＥ７０４（Ｓ）：ＨＯＭＯ ＣＰＤ—Ｅｔ：ＨＯＭＯ一１ Ｍｅ．ＣＰＤ：ＨＯＭＯ Ｍｅ—ＣＰＤ：ＨＯＭＯ．１ ＨＯＥ７０４（Ｓ）：ＨＯＭＯ ＨＯＥ７０４（Ｓ）：ＨＯＭＯ一１ 枣啦 ＨＯＩＶ：ＨＯＭＯ一１ 图４抑制剂及反应中间体的ＨＯＭＯ和ＨＯＭＯ－－１ Ｆｉｇｕｒｅ ４ ＨＯＭＯ ａｎｄ ＨＯＭＯ＂ｌ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｎｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ 维普资讯 http://www.cqvip.com ｌ７００ 化学学报 Ｖｂ１．６５．２００７ 妇僻 ｐＯＨＡ ＨＯＥ７０４（Ｒ）ＨＯＥ７０４（Ｓ） 子及吡唑环上两个带负电的Ｎ原子结合到活性位点的 Ｍｇ 上，从结合模式上与其它抑制剂及ＨＯＩＶ类似； ＨＯＭＯ（－－０．０８８９２ Ｈａｒｔｒｅｅ）中与Ｍｇ 结合的原子占有相 当的布居；且静电势计算表明，与Ｍｇ 作用的Ｏ及Ｎ 原子上均带有较多的负电荷．总的说来，ＺＩＮＣ０２０２７９２５ 与其它抑制剂及ＨＯＩＶ具有一定程度的相似性，是一个 毋 妇 潜在的靶向ＫＡＲＩ的抑制剂．将本文研究ＫＡＲＩ与其抑 制剂问的相互作用得出的一些结论应用到数据库筛选 后得到的潜在分子的进一步筛选，将有利于发现新型的 靶向ＫＡＲＩ的抑制剂．数据库筛选及有关的合成、生物 ＣＰＤ 图５抑制剂及反应中间体的静电势图 Ｆｉｇｕｒｅ ５ Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｄｅｎｓｉｔｙ （ｉｓｏｖａｌｕｅ＝０．０４） 步说明了羧基是这些抑制剂产生抑制剂活性的关键基 团，进一步可推断可电离带负电基团可能是潜在抑制剂 的结构特征．比较抑制剂与反应中间体ＨＯＩＶ的静电势 可见，这些抑制剂在静电势的分布上与ＨＯＩＶ同样具有 一定的相似性，在与Ｍｇ 结合的部位基本上都是一些 静电势较负的区域（图中深色部分）．竞争性抑制剂和反 应中问体在静电势分布和前线轨道的分布两个方面均 具有一定的相似性，这可能是抑制剂产生抑制效应的分 子基础，为日后靶向ＫＡＲＩ抑制剂的设计和开发提供了 重要的和有力的线索． ２．４在基于ＫＡＲｌ与抑制剂相互作用的数据库筛选中 的应用 脚 基于上述分析与讨论可见，活性位点的Ｍｇ 对于 酶活性位点的静电性质及抑制剂的结合起到重要作用， 故在基于ＫＡＲＩ结构的虚拟筛选中，应该采用活性位点 包含Ｍｇ 的靶酶结构．同时考虑到辅助因子ＮＡＤＰＨ比 抑制剂先结合到靶酶上且占据了活性位点的部分空间， 受体结构中应同时包含活性位点的Ｍｇ 和ＮＡＤＰＨ． 应用ｅＨｉＴＳ软件包对ＺＩＮＣ／ｄｒｕｇ—ｌｉｋｅ三维小分子数 据库进行筛选，其中ＺＩＮＣ０２０２７９２５（［］６ａ）是候选化合物 中打分较高的一个化合物（预测ｌｏｇ Ｋｉ为一７．０６）．下面根 据上述的讨论分析这种化合物作为潜在抑制剂的可能 性．ＺＩＮＣ０２０２７９２５是一个ＮＯ２及Ｃｌ取代的吡唑类化合 物，由于ＮＯ２和Ｃｌ强吸电子基团的吸电子效应，吡唑Ｎ 上的Ｈ将具有一定的酸性，通过Ｍａｒｖｉｎ程序预测其ｐＫａ 值为５．７６，在ｐＨ＝７时９４％电离成其离子化状态，且当 该化合物结合到酶的结合位点，由于Ｍｇ 的促进电离 作用，离子化将变得更容易．因此该化合物符合ＫＡＲＩ 的抑制剂拥有一个可电离成负电基团的化合物这一标 准；分子对接显示该化合物能以ＮＯ 上的其中一个０原 活性测定工作正在进行中． １５ 。 Ｎ， ＺＩＮＣ０２０２７９２５ ｂ 哼ＺＩＮＣ０２０２７９２５ 吁 ｃ ｄ 图６潜在抑制剂的结构式（ａ）、结合方式（ｂ）、ＨＯＭＯ（ｃ）及静 电势图（ｄ） Ｆｉｇｕｒｅ ６ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（ａ），ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅ（ｂ），ＨＯＭＯ（Ｃ）ａｎｄ ＥＳＰ （ｄ）ｏｆ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＺＩＮＣ０２０２７９２５） ３结论 基于ＫＡＲＩ与其抑制剂ＩｐＯＨＡ的晶体结构（ＰＤＢ号： １ＹＶＥ），采用ＭＣＣＥ、分子对接及密度泛函等方法研究 了ＫＡＲＩ与其抑制剂间的相互作用．研究结果表明，活 性位点的Ｍｇ 对于酶活性位点残基及抑制剂的离子化 状态、活性位点静电性质及其与抑制剂的结合起到了重 要的作用；根据计算所得的酶活性位点性质及目前靶向 ＫＡＲＩ抑制剂的分析可见，可电离羧基是抑制剂一个重 要的结构特征，进一步推广可认为可电离成负电荷的基 团可能是潜在抑制剂的主要结构特征；同时，抑制剂在 与靶酶的结合方式上、前线轨道布居及静电势等方面与 Ｈ 、］Ｈ ９ 维普资讯 http://www.cqvip.com ６ ７ ８ ９ Ｏ ● Ｎｏ．１６ 陈沛全等：酮醇酸还原异构酶（ＫＡＲ１）与其抑制剂间相互作用的分子模拟研究 １７Ｏ１ 酶促反应中间体（ＨＯＩＶ）具有一定的相似性．根据以上 结论，对数据库筛选的结果进行进一步的判断及合成， 将有利于发现新型的靶向ＫＡＲｌ的抑制剂． 谨以此文敬贺张滂先生九十华诞． Ｒｅｆｅ ｒｅｎｃｅｓ ｌ Ｄｕｍａｓ，Ｒ．；Ｂｉｏｕ，Ｖ．；Ｈａｌｇａｎｄ，Ｆ．；Ｄｏｕｃｅ，Ｒ．；Ｄｕｇｇｌｅｂｙ，Ｒ． Ｇ．Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２０Ｏ１，３４，３９９． ２ Ｗａｎｇ，Ｂ．一Ｌ．；Ｌｉ，Ｚ．一Ｍ．Ｃｈｉｎ．Ｊ．Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ Ｓｃｉ．２００４，６，ｌｌ （ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ）． （王宝雷，李正名，农药学学报，２００４，６，ｌ１．） Ｃｈａｌｅｆｆ，Ｒ．Ｓ；Ｍａｕｖａｉｓ，Ｃ．Ｊ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８４，２２４，１４４３． Ｓｈａｎｅｒ，Ｄ．Ｌ．；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｐ．Ｃ．；Ｓｔｉｄｈａｍ，Ｍ．Ａ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏ１．１９８４，７６，５４５． Ｈａｌｇａｎｄ，Ｆ．；Ｖｉｖｅｓ，Ｆ．；Ｄｕｍａｓ，Ｒ．；Ｂｉｏｕ，Ｖ．；Ａｎｄｅｓｅｎ，Ｊ．； Ａｎｄｒｉｅｕ，Ｊ．－Ｐ．；Ｃａｎｔｅｇｒｉｌ，Ｒ．；Ｇａｇｎｏｎ，Ｊ．；Ｄｏｕｃｅ，Ｒ．；Ｆｏｒｅｓｔ， Ｅ．；Ｊｏｂ，Ｄ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９８，３７，４７７３． Ａｕｌａｂａｕｇｈ，Ａ．；Ｓｃｈｌｏｓｓ，Ｊ．Ｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙｒ １９９０，２９，２８２４． Ｓｃｈｕｌｚ，Ａ．；Ｓｐｏｎｅｍａｎｎ，Ｐ．；Ｋｏｃｈｅｒ，Ｈ．；Ｗｅｎｇｅｎｍａｙｅｒ，Ｆ． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９８８。２３８．３７５． Ｌｅｅ，Ｙ．一Ｔ．；Ｔａ，Ｈ．Ｔ．；Ｄｕｇｇｌｅｂｙ，Ｒ．Ｇ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．２００５，１６８， ｌ０３５． Ｂｉｏｕ，Ｖ．；Ｄｕｍａｓ，Ｒ．；Ｃｏｈｅｎ—Ａｄｄａｄ，Ｃ．；Ｄｏｕｃｅ，Ｒ．；Ｊｏｂ，Ｄ．； Ｐｅｂａｙ—Ｐｅｙｒｏｕｌａ，Ｅ．ＥＭＢＯ Ｊ．１９９７，１６，３４０５． Ｔｈｏｍａｚｅａｕ，Ｋ．：Ｄｕｍａｓ，Ｒ．；Ｈａｌｇａｎｄ，Ｆ．；Ｆｏｒｅｓｔ，Ｅ．；Ｄｏｕｃｅ， Ｒ．；Ｂｉｏｕ，Ｖ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ ２０００，５６，３８９． Ｗａｎｇ，Ｂ．一Ｌ．；Ｌｉ，Ｚ．・Ｍ．；Ｍａ，Ｙ．；Ｗａｎｇ，Ｊ．－Ｇ．；Ｌｕｏ，Ｘ．一Ｍ．； Ｚｕｏ，Ｚ．一Ｌ．Ｃｈｉｎ．Ｊ．０ｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００４，２４，９７３（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ）． （王宝雷，李正名，马翼，王建国，罗小民，左之利，有机 化学，２Ｏ０４，２４，９７３．） Ｗａｎｇ，Ｂ．一Ｌ．；Ｗａｎｇ，Ｊ．－Ｇ．；Ｍａ，Ｙ．；Ｌｉ，Ｚ．一Ｍ．；Ｌｉ，Ｙ．一Ｈ．； Ｗａｎｇ，Ｓ．－Ｈ．Ａｃｔａ Ｃｈｉｍ．Ｓｉｎｉｃａ ２００６，６４，ｌ ３７３（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ）． （王宝雷，王建国，马翼，李正名，李永红，王素华，化学 学报，２００６，６４，ｌ ３７３．） １３ Ｗｅｓｓｅｌ，Ｐ．Ｍ．；Ｂｉｏｕ，Ｖ．；Ｄｏｕｃｅ，Ｒ．；Ｄｕｍａｓ，Ｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ— ｔｒｙ １９９８．３７．１２７５３． ｌ４ Ｇｅｏｒｇｅｓｃｕ，Ｒ．Ｅ．；Ａｌｅｘｏｖ，Ｅ．Ｇ．；Ｇｕｎｎｅｒ，Ｍ．Ｒ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ． ２ＯＯ２．部．１７３１． ｌ５ ｈｔｔｐ＂／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍａｘｏｎ．ｃｏｍ ｌ６ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｙｅｓｏｐｅｎ．ｃｏｍ Ｉ７ Ｍｏｒｉｒｓ，Ｇ．Ｍ．；Ｇｏｏｄｓｅｌｌ，Ｄ．Ｓ．；Ｈａｌｌｉｄａｙ，Ｒ．；Ｈｕｅｙ，Ｒ．； Ｈａｒｔ，Ｗ．Ｅ．；Ｂｅｌｅｗ，Ｒ．Ｋ．；Ｏｌｓｏｎ，Ａ．Ｊ．Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ． １９９８，１９，ｌ６３９． ｌ８ ｈｔｔｐ：／／ａｕｔｏｄｏｃｋ．ｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ａｄｔ ｌ９ Ｆｒｉｓｃｈ，Ｍ．Ｊ．；Ｔｒｕｃｋｓ，Ｇ Ｗ．；Ｓｃｈｌｅｇｅｌ，Ｈ．Ｂ．；Ｓｃｕｓｅｒｉａ，Ｇ Ｅ．； Ｒｏｂｂ．Ｍ．Ａ．：Ｃｈｅｅｓｅｍａｎ，Ｊ．Ｒ．：Ｃｈｅｅｓｅｍａｎ，Ｊ．Ｒ．；Ｍｏｎｔ— ｇｏｍｅｒｙ，Ｊ．Ａ．ｎ；Ｖｒｅｖｅｎ，Ｔ；Ｋｕｄｉｎ，Ｋ．Ｎ．；Ｂｕｒａｎｔ，Ｊ．Ｃ．； Ｍｉｌｌａｍ，Ｊ．Ｍ．；Ｉｙｅｎｇａｒ，Ｓ．Ｓ．；Ｔｏｍａｓｉ，Ｊ．；Ｂａｒｏｎｅ，Ｖ；Ｍｅｎ— ｎｕｃｃｉ，Ｂ．；Ｃｏｓｓｉ，Ｍ．；Ｒｅｇａ，Ｇ Ｍ．Ｎ．；Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ，Ｇ Ａ．；Ｎａ— ｋａｔｓｕｊｉ，Ｈ．：Ｈａｄａ，Ｍ．；Ｅｈａｒａ，Ｍ．；Ｔｏｙｏｔａ，Ｋ．：Ｆｕｋｕｄａ，Ｒ．； Ｈａｓｅｇａｗａ，Ｊ．；Ｉｓｈｉｄａ，Ｍ．；Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｔ；Ｈｏｎｄａ，Ｙ；Ｋｉｔａｏ， Ｏ．；Ｎａｋａｉ，Ｈ．；Ｋｌｅｎｅ，Ｍ．；Ｌｉ，Ｘ．；Ｋｎｏｘ，Ｊ．Ｅ．；Ｈｒａｔｃｈｉｎａ，Ｈ． Ｐ；Ｃｒｏｓｓ，Ｊ．Ｂ．；Ａｄａｍｏ，Ｃ．；Ｊａｒａｍｉｌｌｏ，Ｊ．；Ｇｏｍｐｅｒｔｓ，Ｒ．； Ｓｔｒａｔｍａｎｎ，Ｒ．Ｅ．；Ｙａｚｙｅｖ，Ｏ．；Ａｕｓｔｉｎ，Ａ．Ｊ．；Ｃａｍｍｉ，Ｒ．； Ｐｏｍｅｌｌｉ，Ｃ．；Ｏｃｈｔｅｒｓｋｉ，Ｊ．Ｗ．；Ａｙａｌａ，Ｅ Ｙ；Ｍｏｒｏｋｕｍａ，Ｋ．； Ｖｏｔｈ，Ｇ Ａ．；Ｓａｌｖａｄｏｒ，Ｐ．；Ｄａｎｎｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｊ．；Ｚａｋｒｚｅｗｓｋｉ，Ｖ Ｇ；Ｄａｐｐｒｉｃｈ，Ｓ．；Ｄａｎｉｅｌｓ，Ａ．Ｄ．；Ｓｔｒａｉｎ，Ｍ．Ｃ．；Ｆａｒｋａｓ，Ｏ．； Ｍａｌｉｃｋ，Ｄ．Ｋ．；Ｒａｂｕｃｋ，Ａ．Ｄ．；Ｒａｇｈａｖａｃｈａｒｉ，Ｋ．；Ｆｏｒｅｓｍａｎ， Ｊ．Ｂ．；０ｒｔｉｚ，Ｊ．Ｖ；Ｃｕｉ，Ｑ．；Ｂａｂｏｕｌ，Ａ．Ｇ；Ｃｌｉｆｆｏｒｄ，Ｓ．；Ｃｉ— ｏｓｌｏｗｓｋｉ，Ｊ．；Ｓｔｅｆａｎｏｖ，Ｂ．Ｂ．；Ｌｉｕ，Ｇ；Ｌｉａｓｈｅｎｋｏ，Ａ．； Ｐｉｓｋｏｒｚ，Ｐ；Ｋｏｍａｒｏｍｉ，Ｉ．；Ｍａｒｔｉｎ，Ｒ．Ｌ．；Ｆｏｘ，Ｄ．Ｊ．；Ｋｅｉｔｈ， Ｔ；Ａ１一Ｌａｈａｍ，Ｍ．Ａ．；Ｐｅｎｇ，Ｃ．Ｙ；Ｎａｎａｙａｋｋａｒａ，Ａ．；Ｃｈａｌ— ｌａｃｏｍｂｅ，Ｍ．；Ｇｉｌｌ，Ｐ．Ｍ．Ｗ．；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｂ．；Ｃｈｅｎ，Ｗ．；Ｗｏｎｇ， Ｍ．Ｗ．；Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｃ．；Ｐｏｐｌｅ，Ｊ．Ａ．Ｇａｕｓｓｉａｎ ０３，Ｒｅｖｉｓｉｏｎ Ｃ． ０ １，Ｇａｕｓｓｉａｎ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄ，Ｃ ２００４． （Ａ０７０１２１９ ＤＩＮＧ Ｗ Ｆ；ＦＡＮ，Ｙ Ｙ）
