环氧角鲨烯的制备方法及工程菌[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 112322675 A(43)申请公布日 2021.02.05

(21)申请号 202011221068.4(22)申请日 2020.11.05

(71)申请人 苏州大学

地址 215000 江苏省苏州市相城区济学路8

号(72)发明人 王崇龙　金善元　邵喜喜　效啸　

周沈婷　俞相明　(74)专利代理机构 苏州谨和知识产权代理事务

所(特殊普通合伙) 32295

代理人 叶栋(51)Int.Cl.

C12P 17/02(2006.01)C12N 1/21(2006.01)C12N 15/70(2006.01)C12R 1/19(2006.01)

(54)发明名称

环氧角鲨烯的制备方法及工程菌(57)摘要

本发明涉及一种环氧角鲨烯的制备方法及工程菌，该制备方法将截短型酿酒酵母角鲨烯合成酶与荚膜甲基球菌角鲨烯环氧化酶基因、Fluviicola taffensis角鲨烯环氧化酶或截短型大鼠角鲨烯环化酶中的其中之一在大肠杆菌中进行表达，所得到的ML‑SQE4、ML‑SQE3和ML‑SQE2工程菌实现了三萜类化合物合成途径关键前体环氧角鲨烯的合成，为生物合成三萜类化合物提供了重要借鉴。

权利要求书1页 说明书6页

序列表7页 附图4页

CN 112322675 ACN 112322675 A

权　利　要　求　书

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1.一种环氧角鲨烯的制备方法，其特征在于，包括：在大肠杆菌中表达角鲨烯合酶和角鲨烯环氧化酶；所述角鲨烯合酶的编码基因为截短型酿酒酵母角鲨烯合成酶基因erg9TC，所述角鲨烯环氧化酶的编码基因为荚膜甲基球菌角鲨烯环氧化酶基因：McSE基因、Fluviicola taffensis角鲨烯环氧化酶基因：FtSE基因或截短型大鼠角鲨烯环化酶基因：RnSETC基因中的任一种；所述erg9TC的序列为SEQ ID NO.1，所述McSE基因的序列为SEQ ID NO.2，所述FtSE基因的序列为SEQ ID NO.3，所述RnSETC基因的序列为SEQ ID NO.4。

2.如权利要求1所述的环氧角鲨烯的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

S1、构建含有所述erg9TC的pSMLSQ载体；S2、分别构建含有所述McSE、FtSE和RnSETC的pTMcSE载体、pTFtSE载体和pTRnSETC载体。3.如权利要求2所述的环氧角鲨烯的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述pSMLSQ载体由所述erg9TC克隆至pSMvL2载体中构建而成。

4.如权利要求3所述的环氧角鲨烯的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述pTMcSE载体、pTFtSE载体和pTRnSETC载体分别由所述McSE、FtSE和RnSETC克隆至pTrc99A载体中构建而成。

5.如权利要求4所述的环氧角鲨烯的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括：S3、将所述pTMcSE载体、pTFtSE载体和pTRnSETC载体分别与pSMLSQ载体共转化大肠杆菌，分别得到表达角鲨烯合酶和角鲨烯环氧化酶的ML-SQE4、ML-SQE3和ML-SQE2工程菌；

S4、培养所述ML-SQE4、ML-SQE3和ML-SQE2工程菌得到环氧角鲨烯。6.如权利要求4所述的环氧角鲨烯的制备方法，其特征在于，还包括在所述大肠杆菌中过表达醌氧化还原酶，所述醌氧化还原酶的编码基因为WrbA基因，所述WrbA基因的序列为SEQ ID NO.5。

7.如权利要求6所述的环氧角鲨烯的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括：S3、将所述WrbA基因克隆至所述pSMLSQ载体构建pSMLSQWrbA载体；S4、将所述pTMcSE载体、pTFtSE载体和pTRnSETC载体分别与pSMLSQWrbA载体共转化大肠杆菌，分别得到表达角鲨烯合酶、角鲨烯环氧化酶和醌氧化还原酶的ML-SQE4-WrbA-b、ML-SQE3-WrbA-b和ML-SQE2-WrbA-b工程菌；

S5、培养所述ML-SQE4-WrbA-b、ML-SQE3-WrbA-b和ML-SQE2-WrbA-b工程菌得到环氧角鲨烯。

8.一种根据如权利要求1至5中任一项所述的制备方法制得的环氧角鲨烯工程菌，其特征在于，所述环氧角鲨烯工程菌为ML-SQE4、ML-SQE3和ML-SQE2工程菌。

9.一种根据如权利要求1至4和6至7中任一项所述的制备方法制得的环氧角鲨烯工程菌，其特征在于，所述环氧角鲨烯工程菌为ML-SQE4-WrbA-b、ML-SQE3-WrbA-b和ML-SQE2-WrbA-b工程菌。

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环氧角鲨烯的制备方法及工程菌

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技术领域

[0001]本发明涉及一种环氧角鲨烯的制备方法及工程菌，属于生物基因工程领域。背景技术

[0002]三萜类化合物是一类广泛应用于医药、保健和化妆品等行业的天然产物，具有巨大的商业价值。生物合成三萜类化合物依赖于环氧角鲨烯的高效合成。角鲨烯环氧化酶是整个合成途径中的关键酶，它能够催化NAD(P)H依赖的环氧化反应，将角鲨烯转变为环氧角鲨烯。[0003]角鲨烯环氧化酶(squalene epoxidase)催化形成2,3-环氧角鲨烯是整个通路中的第一个重要限速环节。角鲨烯环化酶是一种非细胞色素P450酶系 (cytochrome P450，CYP450)的环氧化烯烃酶。它不含有血红素，活性位点不需要结合金属离子；然而，该酶促反应处需要分子氧[O]外，还需要辅因子FAD、 NAD(P)H的参与。催化过程如同某些细胞色素P450酶系反应一样，还原型黄素蛋白接受分子氧[O]形成亲电体，再将分子氧[O]传递给角鲨烯产生。氧化型黄素蛋白则需要如同细胞色素P450还原酶(cytochrome P450 reductase，CPR)作用下以NAD(P)H为电子供体偶联还原。发明内容

[0004]本发明的目的在于提供一种环氧角鲨烯的制备方法及工程菌，实现了三萜类化合物合成途径关键前体环氧角鲨烯的合成，为生物合成三萜类化合物提供了重要借鉴。[0005]为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：一种环氧角鲨烯的制备方法，包括：在大肠杆菌中表达角鲨烯合酶和角鲨烯环氧化酶；所述角鲨烯合酶的编码基因为截短型酿酒酵母角鲨烯合成酶基因erg9TC，所述角鲨烯环氧化酶的编码基因为荚膜甲基球菌角鲨烯环氧化酶基因：McSE基因、Fluviicola taffensis角鲨烯环氧化酶基因：FtSE基因或截短型大鼠角鲨烯环化酶基因：RnSETC基因中的任一种；所述erg9TC的序列为SEQ ID NO.1，所述McSE基因的序列为SEQ ID NO.2，所述FtSE基因的序列为SEQ ID NO.3，所述RnSETC基因的序列为SEQ ID NO.4。[0006]进一步地，所述制备方法包括以下步骤：[0007]S1、构建含有所述erg9TC的pSMLSQ载体；[0008]S2、分别构建含有所述McSE、FtSE和RnSETC的pTMcSE载体、pTFtSE 载体和pTRnSETC载体。

[0009]进一步地，步骤S1中，所述pSMLSQ载体由所述erg9TC克隆至pSMvL2 载体中构建而成。

[0010]进一步地，步骤S2中，所述pTMcSE载体、pTFtSE载体和pTRnSETC载体分别由所述McSE、FtSE和RnSETC克隆至pTrc99A载体中构建而成。[0011]进一步地，所述制备方法还包括：[0012]S3、将所述pTMcSE载体、pTFtSE载体和pTRnSETC载体分别与pSMLSQ 载体共转化大

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肠杆菌，分别得到表达角鲨烯合酶和角鲨烯环氧化酶的ML-SQE4、 ML-SQE3和ML-SQE2工程菌；

[0013]S4、培养所述ML-SQE4、ML-SQE3和ML-SQE2工程菌得到环氧角鲨烯。[0014]进一步地，还包括在所述大肠杆菌中过表达醌氧化还原酶，所述醌氧化还原酶的编码基因为WrbA基因，所述WrbA基因的序列为SEQ ID NO.5。[0015]进一步地，所述制备方法还包括：[0016]S3、将所述WrbA基因克隆至所述pSMLSQ载体构建pSMLSQWrbA载体；[0017]S4、将所述pTMcSE载体、pTFtSE载体和pTRnSETC载体分别与 pSMLSQWrbA载体共转化大肠杆菌，分别得到表达角鲨烯合酶、角鲨烯环氧化酶和醌氧化还原酶的ML-SQE4-WrbA-b、ML-SQE3-WrbA-b和ML-SQE2-WrbA-b 工程菌；[0018]S5、培养所述ML-SQE4-WrbA-b、ML-SQE3-WrbA-b和ML-SQE2-WrbA-b 工程菌得到环氧角鲨烯。

[0019]本申请还提供一种根据所述的制备方法制得的环氧角鲨烯工程菌，所述环氧角鲨烯工程菌为ML-SQE4、ML-SQE3和ML-SQE2工程菌。

[0020]本申请还提供一种根据所述的制备方法制得的环氧角鲨烯工程菌，所述环氧角鲨烯工程菌为ML-SQE4-WrbA-b、ML-SQE3-WrbA-b和ML-SQE2-WrbA-b 工程菌。[0021]与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本申请的环氧角鲨烯的制备方法及工程菌将截短型酿酒酵母角鲨烯合成酶与荚膜甲基球菌角鲨烯环氧化酶基因、Fluviicola taffensis角鲨烯环氧化酶或截短型大鼠角鲨烯环化酶中的其中之一在大肠杆菌中进行表达，所得到的ML-SQE4、ML-SQE3和ML-SQE2工程菌实现了三萜类化合物合成途径关键前体环氧角鲨烯的合成，为生物合成三萜类化合物提供了重要借鉴。[0022]同时，本申请还通过在大肠杆菌中过表达醌氧化还原酶WrbA完成角鲨烯的加氧作用，进一步提高了环氧角鲨烯的产量。

[0023]上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。附图说明

[0024]图1A为本发明一实施例所示的大肠杆菌中环氧角鲨烯的表达构建示意图；[0025]图1B为本发明一实施例所示的环氧角鲨烯含量的气相色谱分析图；

[0026]图2A为本发明一实施例中不同种类的角鲨烯环氧化酶的表达构建示意图；

[0027]图2B和图2C为本发明一实施例所示的环氧角鲨烯含量的气相色谱-质谱分析图；[0028]图3A为本发明一实施例所示的强Trc启动子CPRL表达构建示意图；

[0029]图3B为本发明一实施例所示的ML-SQE2-CRPL-a系列工程菌在培养48小时候的细胞生长和环氧角鲨烯含量的分析图；

[0030]图3C为本发明一实施例所示的重度lac启动子CPRL表达构建示意图；

[0031]图3D为本发明一实施例所示的ML-SQE2-CRPL-b系列工程菌在培养48小时候的细胞生长和环氧角鲨烯含量的分析图。

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具体实施方式

[0032]下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来本发明的范围。[0033]一、载体构建

[0034]市面上购买或自行制备：大肠杆菌中完整MVA途径表达载体pSNA；由 MVA到(isoprenyl diphosphate，IPP)和双甲基丙烯基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate，DMAPP)合成途径表达载体pSMvL2；pTrc99A载体；所采用的其他常见试剂和材料。[0035]将截短型酿酒酵母角鲨烯合成酶基因erg9TC用BamH I和Sal I性内切酶消化、回收后，亚克隆到pSMvL2载体上构建pSMLSQ载体。

[0036]按照大肠杆菌密码子偏爱性合成了荚膜甲基球菌(Methylococcus capsulatus) 角鲨烯环化酶基因McSE、Fluviicola taffensis角鲨烯环化酶基因FtSE、截短型大鼠(Rattus norvegicus)角鲨烯环化酶基因RnSETC，通过合成的基因上下游分别引入酶切位点BamH I和Bgl II、Sal I，再亚克隆到pTrc99A载体构建pTMcSE、 pTFtSE和pTRnSETC。[0037]通过PCR从大肠杆菌MG1655基因组扩增NAD(P)依赖的氧化还原酶基因 ytfG、NADPH：醌氧化还原酶基因mdaB、NAD(P)H-黄素还原酶基因fre、tRNA 结合蛋白基因ygjH、硫氧还蛋白还原酶基因trxB、NADPH依赖的FMN还原酶基因ssuE、NADH：醌氧化还原酶基因wrbA，并通过上下游引物引入的性内切位点Sal I和BamH I，分别将这7个CPRL(CPR-like，内源性CPR样)基因克隆到pTRnSETC构建pTRnSETCCPRL系列载体。同样，将上述CPRL相关基因克隆到pSMLSQ构建成pSMLSQ-CPRL系列载体。[0038]二、菌株和培养条件[0039]大肠杆菌DH5α用作载体克隆和环氧角鲨烯合成的宿主菌。将含有不同合成环氧角鲨烯模块的载体转化到大肠杆菌DH5α中构建各环氧角鲨烯工程菌株，其详细信息见表3。挑取重组大肠杆菌DH5α于LB培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L)中，在37℃恒温气浴摇床中，以200rpm振荡培养12h用作载体的克隆和扩增。环氧角鲨烯工程菌的培养时，首先挑取单克隆于2YT培养基(胰蛋白胨16g/L、酵母提取物10g/L、氯化钠5g/L)中，在30℃恒温气浴摇床中，以200rpm振荡培养12h作为种子液，再以0.1OD600的接种量接种到含有2％甘油(v/v)和0.1mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的新鲜2YT培养基，在30℃恒温气浴摇床中，以200rpm振荡培养48h后，用于环氧角鲨烯产量的检测。培养时根据需要加入氨苄青霉素和(或)氯霉素至终浓度100mg/L和50mg/L。[0040]三、环氧角鲨烯的提取和测定[0041]将48h培养液进行高转速离心，收集沉淀并用一定体积的灭菌水悬浮。悬浮后的样品与等体积的氯仿和甲醇混合，震荡萃取1h；然后转移上层氯仿相到新Eppendorf管中。再用一体积的氯仿以相同的方式萃取一次。使用真空离心浓缩仪从去除氯仿相，最后将其重新溶解在乙酸乙酯中用于气相色谱和质谱分析。

[0042]环氧角鲨烯定性分析使用配有FID的气相色谱仪(GC；Agilent Technologies 70A)进行。样品以1:10的分流比注入19091N-133HP-INNOWAX色谱柱(长度30m；内径250μm；膜厚0.25μm)。GC条件如下：初始烘箱温度为50℃，保持1分钟，以5℃/min的速率加热至80℃，然后再以40℃/min的速率加热至 260℃，以最终温度为260℃保持1分钟；检测器温度保持为260℃。在相同的气相色谱条件下，用气相色谱-质谱法(GC-MS；GCMS-2010ultra；

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Shimadzu)对样品各析出峰进行表征，数据采集的m/z范围为40～350，溶剂延迟cut-off时间为2.5min。[0043]四、结果[0044](一)基于酿酒酵母基因的环氧化角鲨烯的生物合成途径的构建

[0045]本实施例通过串联截短的酿酒酵母角鲨烯合酶基因erg9(erg9TC)和大肠杆菌FPP合酶基因ispA，构建了角鲨烯合成模块IspA-Erg9TC(pTispAErg9TC)。在此基础上，引入酵母角鲨烯环氧化酶基因erg1构建环氧角鲨烯合成模块 IspA-Erg9TC-Erg1(pTSQErg1)。考虑到角鲨烯的环氧化反应需要CPR辅因子的参与，本实施例串联了酵母NADPH依赖性CPR辅因子基因ncp1构建 pTSQErg1Ncp1表达载体(如图1A所示)。甲羟戊酸途径表达模块(pSNA)能够在大肠杆菌中利用乙酰辅酶A(acetyl-CoA)从头合成异IPP和DMAPP前体。[0046]将新构建的质粒与其分别共转化大肠杆菌DH5α中获得工程菌株NA-SQE1 和NA-SQE1-Ncp1；将pSNA和pTispAErg9TC共转化获得工程菌株NA-SQ，用作无法进行环氧角鲨烯合成的对照组。将所构建的工程菌培养48h后，提取合成产物并进行气相色谱(GC)分析。如图1B所示，角鲨烯标准品的保留时间约为10.2min，环氧角鲨烯标准品的保留时间约为12.7min。工程菌株NA-SQE1、 NA-SQE1-Ncp1同对照组NA-SQ一样，只有10.2min处的角鲨烯特征峰，而在 12.7min处均没有明显的特征峰，。这一结果表明，无论是否引入CPR辅因子 Ncp1，构建的环氧角鲨烯合成模块IspA-Erg9TC-Erg1都无法将角鲨烯环化形成环氧角鲨烯，因为酵母角鲨烯环氧化酶Erg1的活性可能受到大肠杆菌宿主环境的影响，从而导致加氧失败。[0047](二)角鲨烯环氧化酶在大肠杆菌中的活性筛选[0048]本实施例中研究了角鲨烯环氧化酶FtSE、McSE和RnSETC在大肠杆菌宿主中进行加氧的性能。

[0049]首先，根据大肠杆菌密码子偏爱性对这三个角鲨烯环氧化酶基因FtSE， McSE和RnSETC重新设计，并克隆到有高拷贝数和强启动子的pTrc99A载体构建pTMcSE、pTFtSE和pTRnSETC载体。其次，为内源性供给角鲨烯，角鲨烯合成模块IspA-Erg9TC重新和甲羟戊酸途径下游部分串联构建从甲羟戊酸到角鲨烯的合成模块(pSMLSQ，如图2A所示)。最后，pTMcSE、pTFtSE和pTRnSETC载体与pSMLSQ载体共转化大肠杆菌DH5α获得工程菌株ML-SQE4、ML-SQE3 和ML-SQE2。培养48小时后，GC检测发现，3株工程菌除在10.2min有明显的角鲨烯特征峰(peak 1#)外，在12.7min处也出现与环氧角鲨烯相同滞留时间的特征峰(peak 2#，如图2B所示)。其中，含有大鼠角鲨烯环氧化酶RnSETC的ML-SQE2工程菌株表现出最强的特征峰信号。

[0050]GC-MS进一步分析显示peak 2特征峰确为环氧角鲨烯(如图2C所示)。这一结果表明角鲨烯环氧化酶在大肠杆菌中的活性受到种属来源特异性的影响。同时，也表明大肠杆菌中可能存在存在CPRL辅因子协助角鲨烯环氧化酶共同完成角鲨烯的加氧过程。[0051](三)大肠杆菌内源性CPRL辅因子对环氧角鲨烯合成的影响[0052]为寻找角鲨烯环氧化过程中行使功能的CPRL辅因子，本实施例选取了七个电子传递酶：NAD(P)依赖的氧化还原酶YtfG、NADPH:醌氧化还原酶MdaB、 NAD(P)H-黄素还原酶Fre、NADPH依赖性铁螯合还原酶YqjH、硫氧还蛋白还原酶TrxB、NADPH依赖的FMN还原酶SsuE、NADH：醌氧化还原酶WrbA作为考察对象。

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首先将其与表现优异的角鲨烯环氧化酶基因RnSETC串联构建 pTRnSETCCPRL载体

系列(如图3A所示)，再将七个pTRnSETCCPRL载体分别与PMSLQ载体共转化大肠杆菌，获得ML-SQE2-CRPL-a系列工程菌。培养48h 后，各工程菌细胞生长量与ML-SQE2菌株相比较发现，除了过表达MdaB和 Fre的菌株生长较好外，其余各菌株生长均明显低于ML-SQE2菌株。在环氧角鲨烯合成方面，仅过表达MdaB和Fre的两菌株有环氧角鲨烯的生成，但产量仅为ML-SQE2菌株一半左右，其余各菌株环氧角鲨烯产量均低于检测水平(如图 3B所示)。由于ML-SQE2-CRPL-a系列工程菌中，CPRL被构建在高拷贝的 pTrc99A载体上，同时受到强Trc启动子的控制，电子传递酶作为内膜蛋白，其过表达可能造成细胞生长的抑制；其表达量的增加也有可能打破了呼吸链原有的稳态，影响细胞正常的能量代谢，导致细胞生长缓慢。因此，七个候选CPRL 辅因子被重新构建在中度拷贝和相对较弱的Lac启动子控制的pSMLSQ载体，再与pTRnSETC载体共转化大肠杆菌，获得ML-SQE2-CRPL-b系列工程菌(如图3C所示)。[0054]本实施例实验结果表明，在相同的培养下，ML-SQE2-CRPL-b系列工程菌表现出与ML-SQE2-CRPL-a系列完全不同结果。如图3D所示，各菌株细胞生长量与ML-SQE2菌株相比没有明显差异；除过表达TrxB菌株，其他各菌株均能生成环氧角鲨烯，其中，过表达WrbA菌株(ML-SQE2-WrbA-b)的环氧角鲨烯产量比ML-SQE2菌株提高了近1.5倍。[0055]在本实施例中，所涉及的引物如表1所示，所涉及的菌株如表2所示。[0056]表1

[0057]

[0058]

引物

Erg1-Sal-F Erg1-Hndxho-R NCP1-Xho-F1 NCP1-Hnd-R yqjH-bam-F yqjH-sal-R ssuE-bam-F ssuE-sal-R wrbA-bam-F wrbA-sal-R ytfG-bam-F ytfG-sal-R mdaB-bam-F mdaB-sal-R fre-bam-F fre-xho-R trxB-bam-F trxB-sal-R 表2

序列

CTAGTCGACAGAAGGAGATATACATATGTCTGCTGTTAACGTTGCAC GAGAAGCTTCTCGAGTTAACCAATCAACTCACCAAAC

CTACTCGAGAAGGAGATATACATATGCCGTTTGGAATAGACAACAC GAGAAGCTTACCAGACATCTTCTTGGTATC GCGGATCCAAGGAGATAACAATGAATAACACCC AGTGTCGACTTACTTTGCGTGCCAGTAAGC

GCGGATCCAGGAGAAATATATGCGTGTCATCACCCTGGC AGTGTCGACGATGTTACGCATGGGCATTACC

GCGGATCCAAGGAGATAATAAATGGCTAAAGTTCTGGTGC AGTGTCGACGCATGCGTATCCTCCTGTTG

GCGGATCCAAGGAGAATATAAATGATCGCTATTACTGGTGCC AGTGTCGACGTCATTATCAGAGAGGATGC

GCGGATCCAAGGAGAATATAAATGAGCAACATCCTGATTATC CGTGTCGACAAGCCTGAGCTCTAGTTAAC

GCGGATCCAAGGAGAATATAAATGACAACCTTAAGCTGTAAAGTG GCGGATCCAAGGAGAATATAAATGGGCACGACCAAACACAG GCGGATCCAAGGAGAATATAAATGGGCACGACCAAACACAG CGTGTCGACCATAGTCGCATGGTGTCGC

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[0059]

[0060]

在本实施例中，erg9TC基因、McSE基因、FtSE基因、RnSETC基因、WrbA 基因、YtfG基

因、MdaB基因、Fre基因、YgjH基因、TrxB基因、SsuE基因的序列分别如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.11所示。

[0062]综上所述：本申请的环氧角鲨烯的制备方法及工程菌将截短型酿酒酵母角鲨烯合成酶与荚膜甲基球菌角鲨烯环氧化酶基因、Fluviicola taffensis角鲨烯环氧化酶或截短型大鼠角鲨烯环化酶中的其中之一在大肠杆菌中进行表达，所得到的ML-SQE4、ML-SQE3和ML-SQE2工程菌实现了三萜类化合物合成途径关键前体环氧角鲨烯的合成，为生物合成三萜类化合物提供了重要借鉴。[0063]同时，本申请还通过在大肠杆菌中过表达醌氧化还原酶WrbA完成角鲨烯的加氧作用，进一步提高了环氧角鲨烯的产量。

[00]以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明载的范围。

[0065]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

[0061]

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序列表<110> 苏州大学<120> 环氧角鲨烯的制备方法及工程菌<160> 11<170> SIPOSequenceListing 1.0<210> 1<211> 1260<212> DNA<213> erg9TC gene<400> 1atgggaaagc tattacaatt ggcattgcat ccggtcgaga tgaaggcagc tttgaagctg 60aagttttgca gaacaccgct attctccatc tatgatcagt ccacgtctcc atatctcttg 120cactgtttcg aactgttgaa cttgacctcc agatcgtttg ctgctgtgat cagagagctg 180catccagaat tgagaaactg tgttactctc ttttatttga ttttaagggc tttggatacc 240atcgaagacg atatgtccat cgaacacgat ttgaaaattg acttgttgcg tcacttccac 300gagaaattgt tgttaactaa atggagtttc gacggaaatg cccccgatgt gaaggacaga 360gccgttttga cagatttcga atcgattctt attgaattcc acaaattgaa accagaatat 420caagaagtca tcaaggagat caccgagaaa atgggtaatg gtatggccga ctacatctta 480gatgaaaatt acaacttgaa tgggttgcaa accgtccacg actacgacgt gtactgtcac 540tacgtagctg gtttggtcgg tgatggtttg acccgtttga ttgtcattgc caagtttgcc 600aacgaatctt tgtattctaa tgagcaattg tatgaaagca tgggtctttt cctacaaaaa 660accaacatca tcagagatta caatgaagat ttggtcgatg gtagatcctt ctggcccaag 720gaaatctggt cacaatacgc tcctcagttg aaggacttca tgaaacctga aaacgaacaa 780ctggggttgg actgtataaa ccacctcgtc ttaaacgcat tgagtcatgt tatcgatgtg 840ttgacttatt tggccggtat ccacgagcaa tccactttcc aattttgtgc cattccccaa 900gttatggcca ttgcaacctt ggttttggta ttcaacaacc gtgaagtgct acatggcaat 960gtaaagattc gtaagggtac tacctgctat ttaattttga aatcaaggac tttgcgtggc 1020tgtgtcgaga tttttgacta ttacttacgt gatatcaaat ctaaattggc tgtgcaagat 1080ccaaatttct taaaattgaa cattcaaatc tccaagatcg aacagtttat ggaagaaatg 1140taccaggata aattacctcc taacgtgaag ccaaatgaaa ctccaatttt cttgaaagtt 1200aaagaaagat ccagatacga tgatgaattg gttccaaccc aacaagaaga agagtactaa 1260<210> 2<211> 1350<212> DNA<213> McSE gene<400> 2atgtcgtcta ttgaactggg tgaatgggat gtgctgattg cgggtggtag tgtggcgggc 60tcggctgctg cggcggctct gagtggtctg ggtctgcgtg ttctgattgt cgaaccggac 120

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CN 112322675 A

序　列　表

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