水稻白叶枯病菌快速分离方法[发明专利]

[12]发明专利申请公开说明书

[21]申请号200510048734.8

[51]Int.CI.

C12N 1/20 (2006.01)

[43]公开日2006年7月26日[22]申请日2005.12.22[21]申请号200510048734.8

[71]申请人云南农业大学

地址650201云南省昆明市北郊黑龙潭云南农业

大学[72]发明人姬广海 张世光 陈兴全 何月秋

[11]公开号CN 1807587A

[74]专利代理机构昆明正原专利代理有限责任公司

代理人刘明哲

权利要求书 1 页 说明书 10 页

[54]发明名称

水稻白叶枯病菌快速分离方法

[57]摘要

本发明涉及水稻白叶枯病菌快速分离方法，属微生物技术领域。将含目标病原细菌的水稻病组织，经用75％洒精消毒60－90秒后，用无菌水冲洗，将病组织置于无菌载玻片上，滴加无菌水，室温摆放5－15min，待病原菌从病组织中喷出到切口处的水中，用移菌环沾取含菌液划线于适于水稻白叶枯病菌生长的NA或SX培养基上，25－28℃培养，即可得到相应的目标细菌。本发明分离细菌快速、准确、污染率低、纯度高、菌株变异极小，保持了病原菌野生型的特性。

200510048734.8

权 利 要 求 书

第1/1页

1.水稻白叶枯病菌快速分离方法，其步骤是：

(1)标样选择：选取具有典型症状的水稻白叶枯病标本，在发病扩展前沿病键交界处，剪取0.5-1.5cm组织块；

(2)消毒：首先将组织块用自来水冲洗，选用75％洒精消毒60-90秒，然后用无菌水冲洗3次，稍凉干后用剪刀修剪，去除多余的健康组织；

(3)先将载玻片放入95％乙醇中浸泡，在酒精灯火上轻烧，将消毒过的组织块放在灭菌的载玻片上，两端滴上1滴无菌水，室温静置5-15min，待喷菌现象出现后，用移菌环沾含菌液划线于普通NA或SX培养基上；

(4)细菌培养：24-28℃培养基箱中培养48-72h后观察，根据菌落形态、颜色等细菌培养性状，进行挑选，然后将细菌纯培养保存。

2.根据权利要求所述的水稻白叶枯病菌分离方法，其特征是，所述NA培养基的配方为：牛肉浸膏3g、酵母提取物1g、多聚蛋白胨5g、蔗糖10g、琼脂17g、加水定容至1000ml，调pH至7.0。

3.根据权利要求所述的水稻白叶枯病菌分离方法，其特征是，所述SX培养基配方：可溶性淀粉10g、氯化铵5g、牛肉浸膏1g、磷酸二氢钾2g、琼脂17-20g，加水定容至1000ml，调pH至7.0。

2

200510048734.8

说 明 书

水稻白叶枯病菌快速分离方法

第1/10页

技术领域：

本发明属于微生物技术领域，涉及一种水稻白叶枯病菌快速分离方法。 背景技术：

水稻白叶枯病是亚洲和太平洋地区水稻生产上最重要的细菌性病害之一。水稻白叶枯病是由病原细菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)侵染而引发的一种主要水稻病害，不但严重发生在东南亚各国，而且已经蔓延到澳洲，美洲和非洲。我国目前除外，全国都有不同程度的发生，是水稻上仅次于稻瘟病的重要病害。水稻受害后，一般减产20％～30％，严重的减产50％甚至颗粒无收。水稻抗病品种的培育、利用和病害的流行学研究，以及病原菌的小种分化、群体遗传多样性研究，都离不开快速获得具有致病性的病原细菌分离物。植物病原细菌快速分离和纯培养，无论是在科学试验或是生产实践中都有着重大的理论张实践意义，纯培养意味着从自然界中将特定的微生物分离出来，在人工培养基上增殖。特别是病原细菌，如何有效地去除病组织表面或其内部的其它微生物，快速获得目标病原菌，一直都是植物病理学家关注的重点。

目前，用于水稻白叶枯病菌分离方法多采用沙培法，主要机理为通过对病组织进行保湿，使菌脓从病组织切出口产生，将后将菌脓放在适当培养基上进行分离培养。病组织破碎稀释涂板分离法，该方法主要机理为首先破碎病组织，用无菌水浸提适量含菌液，然后经倍比稀释后，将稀释液置于适当培基上进行分离培养，上述两种方法预处理时间均较长，前者高达20小时，后者分离一个样品也需5小时；操作占用空间大，使用耗材和消耗样品多，另外破碎病组织，使得大量内生细菌或腐生菌浸提出病组织，造成污染率高，上述方法已不适用于水稻白叶枯病菌快速分离的需要，其分离速度太慢，所用空间大，在一定时间内处理的样本量偏少，分离效率低，污染程度高，常因病组织样品处理不及时，使得样品难以处理，浪费了大量的标本。达不到实验中理想病原物快速分离和分离物选择、致病性需求的目的。

3

200510048734.8说 明 书 第2/10页

发明内容：

本发明克服现有水稻白叶枯病菌分离方法的不足，提供了一种能够及时处理水稻白叶枯病害标样，高效、快速、准确获得目标病原物菌分离的方法。 本发明水稻白叶枯病菌快速分离方法，其步骤是： 1.采用载玻片喷菌法快速分离水稻白叶枯病菌：

(1)标样选择：选取具有典型症状的水稻白叶枯病标本，在发病扩展前沿病键交界处，剪取0.5-1.5cm组织块；

(2)消毒：首先将组织块用自来水冲洗，选用75％洒精消毒60-90秒，然后用无菌水冲洗3次，稍凉干后用剪刀修剪，去除多余的健康组织；

(3)将消毒过的组织块放在灭菌的载玻片上(事先将载玻片放入95％乙醇中浸泡，用前在酒精灯火上轻烧)，两端滴上1滴无菌水，室温静止5-15min，待喷菌现象出现后，用移菌环沾含菌液在普通NA或SX培养基划线；

(4)细菌培养：24-28℃培养基箱中培养48-72h后观察，根据菌落形态、颜色等细菌培养性状，进行挑选，然后将细菌纯培养进行保存或和病性验证。

其中步骤1中(4)细菌培养用NA，SX培养基，NA培养基配方：牛肉浸膏3g、酵母提取物1g、多聚蛋白胨5g、蔗糖10g、琼脂17g、加水定容至1000ml，pH调至7.0；SX培养基配方：可溶性淀粉10g，氯化铵5g、牛肉浸膏1g、磷酸二氢钾2g、琼脂17-20g、加水定容至1000ml、调pH至7.0。分装300ml，高压锅灭菌，灭菌条件：温度：121℃，压力：0.15Mpa，灭菌时间：20-25min，待冷却到50-55℃，倒平板，供分离用。 2.液体冷冻法保存：将长好的单菌落，用灭菌芽签挑取少许，直接放入盛有NB液体培养液和灭菌双蒸水的冻存管中，加入甘油至终浓度15％，封口后，立即放入-30℃或-70℃的冰箱中。

3.分离菌株的致病性验证：采用剪叶法接种，接种前，以无菌水洗脱菌落，悬浮均匀，用分光光度计测定细菌菌悬液浓度，OD600nm＝0.5，接种品种包括感病品种，已知抗病基因的鉴别品种等，接种2周和3周后分别测量病斑长度和该叶片的全长，每个菌株测量10张叶片。以三周后调查的病斑长度小于接种叶长的四分之一为抗病(R)，反之大于或等于接种叶长的四分之一为感病(S)。

本方法的有益效果：利用细菌的喷菌现象原理，以载玻片为分离载体，按照本发明的描述的白叶枯病菌快速分离方法，由于本方法分离病原细菌，使用病组织体积小，并

4

200510048734.8说 明 书 第3/10页

且未破坏病组织原始结构，病菌从病组织切口处喷出，含菌液中细菌单一，活力强，与国内同类分离方法相比优点表现在：(1)用该方法分离的水稻白叶枯病菌，能保持原野生型的活性，变异程度极低。解决了其它分离方法污染率高，不易得到目标病原细菌的问题；(2)分离速度快，主要原因是缩短了样品处理时间，由传统沙培法的20小时，缩短为2-3h，该方法与沙培法相比处理样本数量大，减少了病标本使用量，而且分离获得的病原物纯度高；(3)操作简单，简便易行，成本低，应用广泛。该方法除用于分离水稻白叶枯病菌外，还已用于分离水稻细菌性条斑病菌、红掌细菌性疫病等叶斑类植物病原细菌。

具体实施方式 实施例一：

本发明水稻白叶枯病菌快速分离方法，具体步骤是： 1.水稻白叶枯病菌快速分离，具体步骤如下：

(1)标样选择：选取具有典型症状的水稻白叶枯病标本，在发病扩展前沿病键交界处，剪取0.5cm组织块；

(2)消毒：首先将组织块用自来水冲洗，选用75％洒精消毒60秒，然后用无菌水冲洗3次，稍凉干后用剪刀修剪，去除多余的健康组织；

(3)将消毒过的组织块放在灭菌的载玻片上(事先将载玻片放入95％乙醇中浸泡，用前在酒精灯火上轻烧)，两端滴上1滴无菌水，室温静止5min，待喷菌现象出现后，用移菌环沾取含菌液在普通NA培养基划线；

(4)细菌培养：24℃培养基箱中培养48h后观察，根据菌落形态、颜色等细菌培养性状，进行挑选，然后将细菌纯培养进行保存或和病性验证。

2.液体冷冻法保存：将长好的单菌落，用灭菌芽签挑取少许，直接放入盛有NB液体培养液和灭菌双蒸水的冻存管中，加入甘油至终浓度15％，封口后，立即放入-30℃或-70℃的冰箱中。

3.分离菌株的致病性验证：采用剪叶法接种，接种前，以无菌水洗脱菌落，悬浮均匀，用分光光度计测定细菌菌悬液浓度，OD600nm＝0.5，接种品种包括感病品种，已知抗病基因的鉴别品种等，接种2周和3周后分别测量病斑长度和该叶片的全长，每个菌株测量10张叶片。以三周后调查的病斑长度小于接种叶长的四分之一为抗病(R)，反之大于或等于接种叶长的四分之一为感病(S)。

5

200510048734.8说 明 书 第4/10页

沙培法分离水稻白叶枯病菌方法如下：首先要切取水稻白叶枯病病叶子3-5cm，每份标本至少需3片叶，仍采用75％酒精进行表面消毒，然后将病叶插入装有灭菌沙子的瓷缸(直径8cm)中，用无菌水将沙子湿润，然后用两层砂布封口，室温下摆放，20小时后，揭开砂布，用移菌粘取病叶切口处的菌脓，进行划线培养，培养基采用普通NA培养基，根据菌落形态等培养性状，进行选择，即可获得大量水稻白叶枯病菌。同样采用液体冷冻法保存和分离菌株的致病性验证。

4.实施效果：从表1可知，采用本发明的快速分离方法，在处理同样病样时，与采用通用的沙培法分离相比，分离所需时间由48h缩短为4h，提高了分离速度，成本显著降低，不使用砂布和瓷缸，减少了无菌水的用量和占用空间体积由10m减为0.5m。病叶数使用量减少。特别是分离效率显著提高，载玻片喷菌法分离效率为96％，而沙培法仅为40％，污染率显著降低。

   表1.本发明与沙培法分离水稻白叶枯病菌的比较

项目

标样数

分离需要时间消耗病叶数需要载体使用砂布消耗无菌水占用空间体积获得菌株数分离效率

菌株的致病性污染率

载玻片喷菌法504h50张

50个载玻片不使用30ml/样品

2

0.5m46％有4％

沙培法5048h150张

80-100个瓷缸使用

100ml/样品210m2040％有60％

2

2

实施例二：

本发明水稻白叶枯病菌快速分离方法，其步骤是： 1.水稻白叶枯病菌快速分离方法，具体步骤如下：

(1)标样选择：选取具有典型症状的水稻白叶枯病标本，在发病扩展前沿病键交界处，剪取1.5cm组织块；

(2)消毒：首先将组织块用自来水冲洗，选用75％洒精消毒90秒，然后用无菌水冲洗3次，稍凉干后用剪刀修剪，去除多余的健康组织；

(3)将消毒过的组织块放在灭菌的载玻片上(事先将载玻片放入95％乙醇中浸泡，用前在酒精灯火上轻烧)，两端滴上1滴无菌水，室温静止15min，待喷菌现象出现后，

6

200510048734.8说 明 书 第5/10页

用移菌环划线于普通SX培养基上，SX培养基配方：可溶性淀粉10g，氯化铵5g，牛肉浸膏1g，磷酸二氢钾2g，琼脂17g，加水定容至1000ml，调pH至7.0；

(4)细菌培养：28℃培养基箱中培养72h后观察，根据菌落形态、颜色等细菌培养性状，进行挑选，然后将细菌纯培养进行保存或和病性验证。 2.液体冷冻法保存 同实施例一。

3.分离菌株的致病性验证 同实施例一。

病组织破碎稀释涂板法，具体步骤为首先将病组织消毒，采用0.1％升汞进行表面消毒，然后用无菌水冲洗，然后再用选用75％洒精消毒90秒，然后用无菌水冲洗3次，置于已灭菌的培养皿中，用剪刀或玻璃棒破碎，然后加入3-5ml无菌水，室温静止20min，然后用移液管洗取1ml含菌浸出液，进行10x系列稀释，选取10

-3

，10

-4

，10

-5

三个梯度，

每皿涂0.1ml，用自制玻璃涂棒在SX培养基上进行涂板，28℃培养基箱中培养72h后观察，根据菌落形态、颜色等细菌培养性状，进行挑选，然后将细菌纯培养进行保存或和病性验证。

4.实施效果：从表2可知，采用本发明的快速分离方法，在处理同样病样时，与采用通用的沙培法分离相比，分离每个样品所需时间由30min缩短为10min，提高了分离速度，成本显著降低，不使用培养皿，显著减少了无菌水的用量由每个样品需200ml至30ml和占用空间体积由5m减为0.1m。病叶数使用量减少。特别是分离效率显著提高，载玻片喷菌法分离效率为95％，而沙培法仅为50％，污染率显著降低。          表2.本发明与病组织破碎稀释涂板分离法的比较

2

2

项目

标样数

分离需要时间消耗病叶数需要载体

使用试管、涂棒消耗无菌水占用空间体积获得菌株数分离效率

菌株的致病性污染率

载玻片喷菌法20

10min/个20张

20个载玻片不使用30ml/样品

2

0.1m1995％有5％

病组织破碎稀释涂板20

30min/个60-80张

60-80个培养皿使用

200ml/样品25m1050％有50％

7

200510048734.8说 明 书 第6/10页

实施例三

本发明水稻白叶枯病菌快速分离方法，其步骤是： 1.水稻白叶枯病菌快速分离方法，具体步骤如下：

(1)标样选择：选取具有典型症状的水稻白叶枯病标本，在发病扩展前沿病键交界处，剪取1.0cm组织块；

(2)消毒：首先将组织块用自来水冲洗，选用75％洒精消毒75秒，然后用无菌水冲洗3次，稍凉干后用剪刀修剪，去除多余的健康组织；

(3)将消毒过的组织块放在灭菌的载玻片上(事先将载玻片放入95％乙醇中浸泡，用前在酒精灯火上轻烧)，两端滴上1滴无菌水，室温静止10min，待喷菌现象出现后，用移菌环划线于普通SX培养基上，SX培养基配方：可溶性淀粉10g、氯化铵5g、牛肉浸膏1g、磷酸二氢钾2g、琼脂17g、加水定容至1000ml，调pH至7.0；

(4)细菌培养：25℃培养基箱中培养56h后观察，根据菌落形态、颜色等细菌培养性状，进行挑选，然后将细菌纯培养进行保存或和病性验证。 2.液体冷冻法保存 同实施例一。

3.分离菌株的致病性验证 同实施例一。

沙培法分离水稻白叶枯病菌方法如下：首先要切取水稻白叶枯病病叶子3-5cm，每份标本至少需3片叶，仍采用75％酒精进行表面消毒，然后将病叶插入装有灭菌沙子的瓷缸(直径8cm)中，用无菌水将沙子湿润，然后用两层砂布封口，室温下摆放，20小时后，揭开砂布，用移菌粘取病叶切口处的菌脓，进行划线培养，培养基采用普通NA培养基，根据菌落形态等培养性状，进行选择，即可获得大量水稻白叶枯病菌。同样采用液体冷冻法保存和分离菌株的致病性验证。

病组织破碎稀释涂板法，具体步骤为首先将病组织消毒，采用0.1％升汞进行表面消毒，然后用无菌水冲洗，然后再用选用75％洒精消毒90秒，然后用无菌水冲洗3次，置于已灭菌的培养皿中，用剪刀或玻璃棒破碎，然后加入3-5ml无菌水，室温静止20min，然后用移液管洗取1ml含菌浸出液，进行10x系列稀释，选取10

-3

，10

-4

，10

-5

三个梯度，

每皿涂0.1ml，用自制玻璃涂棒在SX培养基上进行涂板，28℃培养基箱中培养72h后观察，根据菌落形态、颜色等细菌培养性状，进行挑选，然后将细菌纯培养进行保存或和病性验证。

8

200510048734.8说 明 书 第7/10页

4.实施效果：从表3可知，采用本发明的快速分离方法，在处理同样病样时，与采用通用的沙培法和病组织破碎稀释涂板分离法分离相比，分离每个样品所需时间分别由1h和30min缩短为10min，提高了分离速度，成本显著降低，不使用纱布、试管、涂棒、培养皿，显著减少了无菌水的用量由每个样品需100ml和200ml至30ml和占用空间体积由25m和4.7m减为0.09m。病叶数使用量减少。特别是分离效率显著提高，载玻片喷菌法分离效率为93％，而沙培法和病组织破碎稀释涂板分离法仅为40％和47％，污染率显著降低。

              表3.本发明与沙培法和病组织破碎稀释涂板分离法的比较

2

2

2

项目载玻片喷菌法沙培法

病组织破碎稀释涂

板15

30min/个60张

45-60个培养皿使用200ml/样品

2

4.7m747％有47％

标样数

分离需要时间消耗病叶数需要载体

使用纱布、试管、涂棒

消耗无菌水占用空间体积获得菌株数分离效率

菌株的致病性污染率

15

10min/个15张

15个载玻片不使用30ml/样品

2

0.09m1493％有3％

151h/个45张

30-40个瓷缸使用100ml/样品225m0％有62％

实施例四：

本发明水稻白叶枯病菌快速分离方法，其步骤是： 1.水稻白叶枯病菌快速分离，具体步骤如下：

(1)标样选择：选取具有典型症状的水稻白叶枯病标本，在发病扩展前沿病键交界处，剪取0.5cm组织块；

(2)消毒：首先将组织块用自来水冲洗，选用75％洒精消毒80秒，然后用无菌水冲洗3次，稍凉干后用剪刀修剪，去除多余的健康组织；

(3)将消毒过的组织块放在灭菌的载玻片上(事先将载玻片放入95％乙醇中浸泡，用前在酒精灯火上轻烧)，两端滴上3滴无菌水，室温静止15min，待喷菌现象出现后，用移菌环划线于普通NA培养基上；

(4)细菌培养：25℃培养基箱中培养56h后观察，根据菌落形态、颜色等细菌培养性状，进行挑选，然后将细菌纯培养进行保存或和病性验证。

9

200510048734.8说 明 书 第8/10页

2.液体冷冻法保存：将长好的单菌落，用灭菌芽签挑取少许，直接放入盛有NB液体培养液和灭菌双蒸水的冻存管中，加入甘油至终浓度15％，封口后，立即放入-30℃或-70℃的冰箱中。

3.分离菌株的致病性验证：采用剪叶法接种，接种前，以无菌水洗脱菌落，悬浮均匀，用分光光度计测定细菌菌悬液浓度，OD600nm＝0.5，接种品种包括感病品种，已知抗病基因的鉴别品种等，接种2周和3周后分别测量病斑长度和该叶片的全长，每个菌株测量10张叶片。以三周后调查的病斑长度小于接种叶长的四分之一为抗病(R)，反之大于或等于接种叶长的四分之一为感病(S)。

4.实施效果：详见表3、4。采用本发明从云南省9个地州约40个县市120点，分离获得和保存菌株约200株，其中40个代表代表菌株的致病性测定表明菌株纯度高，致病性差异明显，能保持菌株的野生型，基本上接自然菌株存在的状态，由强毒性和弱毒性菌株组成，病斑长度从1.9到24.2cm。利用含不同抗病基因的水稻近等基因系品种IRBB5、IRBB4、IRBB3、IRBB14、IRBB1和IR24作为鉴别品种，根据病原菌菌株与这些鉴别品种的互作反应，将采用本发明分离的白叶枯菌株划分为相应的11个小种。对应11个小种互作模式为，R1：抗抗抗抗抗抗；R2：抗抗抗抗抗感；R3：抗抗抗抗感感；R4：抗抗抗感感感；R5：抗抗感感感感；R7：抗感感抗感感；R8：抗感感感感感；R9：感感感感感感；R10：抗感抗抗感感；R12：抗抗感抗感感；R13：抗感抗感感感。            表4.采用本发明分离获得的代表性菌株的致病性测定

菌株号菌株来源在感病品种(IR24)上的抗感表现(病斑长度/全叶长)单位：cm

Y14529Y447X1450Y5Y7Y16大理果子园村鹤庆城东丽江九河金平县者米乡大理古城

晋宁中和乡瓦窑村委会严家村民小组大理古城个旧倘甸村建水曲江镇蒙自县马头寨

4.3(20.9)1.9(27.8)2.0(29.2)4.2(31.0)10.0(34.8)6.3(22.7)10.8(32.4)17.8(22.5)14.8(29.4)18.7(28.2)

10

200510048734.8说 明 书 第9/10页

             续表4.采用本发明分离获得的代表性菌株的致病性测定

菌株号

菌株来源

在感病品种(IR24)上的抗感表现(病斑长度/全叶长)单位：cm

QH4Y2Y3Y6Y17578222360A109167220A9Y1Q15-2A1X6X10X13Y8Q6-3Q7-253A11151239

鹤庆城东

开远市乐百道办事处红河县

建水南庄

石屏县大桥乡阿河寨元谋县能禹镇乐甫村鹤庆城南洱源县沙坝村洱源县周礼营大理市大理镇保山市施甸县鹤庆城西洱源县杨家营腾冲固东洱源县小红社保山市昌宁县勐流乡芒市

保山市隆阳区芒宽乡敢顶村腾冲县马站乡三连村开远卧龙谷元江元谋县

宾川太和乡罗官一队元龙厂河谷新平县

思茅地区普文县

德宏州畹町开发区法坡厂洱源大福村丽江维自剑川东岭

16.3(31.3)15.3(32.5)16.2(26.2)24.2(29.3)18.5(27.0)19.3(29.7)16.3(28.2)11.7(27.3)13.2(27.2)16.2(31.8)16.8(31.0)17.2(28.3)17.5(38.8)16.5(29.2)17.8(31.3)12.4(24.2)17.2(23.2)21.0(29.6)22.3(31.3)14.6(24.0)22.7(27.6)17.7(21.7)19.8(30.3)16.6(27.2)23.7(31.3)15.4(29.7)12.5(23.5)11.2(25.3)10.5(25.2)12.7(28.7)

11

200510048734.8说 明 书 第10/10页

                        表5.云南水稻白叶枯代表菌株小种分化

生理小种类型

鉴别品种IRBB5xa5

IRBB4Xa4

Xa3

Xa14

Xa1

IRBB3

IRBB14

IRBB1

IR24Xa18RSSSSSS

Y14，AH3，5，29，Y4

47，GD38

X14，X17，4-1，50，YN03-02A14

Y5，Y7，Y16，3-2，4-3，QH4，Y2，Y3，Y6，Y17，57，6-1

8，31，22，78，23，25，35，60，A10，73，9，10，16，26，30，

33，34，72，QH3，36，20，A9

Y1，3-1，Q15-2，ScHY-6，6-3，Hun 35，A1，X6，X10，X13，Y8，Q6-3，Q7-2，白元②，

9101213

SRRR

SSRS

SRSR

SRRS

SSSS

SSS

12，19，A8，39，A2，A6

S

63

LXG03-02，Q6-1，Q6-2，Q18-7，59，X1，X15，Y9，76，Q8-5，Q18-2，Q18-3，77Q15-1，53，A11

14，A3，A5，Q17-1，Y11，15，32，QH14，Y10菌株代号

1234578

RRRRRRR

RRRRRSS

RRRRSSS

RRRSSRS

RRSSSSS

12