液相色谱质谱联用技术检测鸡肉中环丙沙星残留量浅析

分析检测Analysis and Testingdoi:10.16736/j.cnki.cn41-1434/ts.2020.21.059液相色谱质谱联用技术检测鸡肉中󰀡环丙沙星残留量浅析Analysis󰀡on󰀡the󰀡Determination󰀡of󰀡Ciprofloxacin󰀡Residues󰀡in󰀡Chicken󰀡by󰀡Liquid󰀡󰀡Chromatography󰀡Mass󰀡Spectrometry◎ 杨晓磊（通辽市食品药品检验所食品室，内蒙古　通辽　028000）(Food Room of Tongliao Testing Institute for Food and Drug Control, Tongliao　028000, China)YANG Xiaolei摘　要：基于液相色谱质谱联用技术检测鸡肉中环丙沙星残留量，试样经EDTA-Mcllvaine缓冲盐溶液提取和净化后，通过HLB固相萃取小柱活化、吸附富集、固定、洗脱等操作，经多反应离子检测。采用此方法测定的加标回收率为103.1%。关键词：鸡肉；液相色谱质谱联用技术；环丙沙星；加标回收率；残留量Abstract：The detection of ciprofloxacin residues in chicken meat is based on liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry technology. After the sample is extracted and purified by the EDTA-Mcllvaine buffer salt solution, it is activated, adsorbed and enriched, fixed, and eluted by the HLB solid phase extraction cartridge, and then tested by multiple reactive ions. The standard addition recovery rate determined by this method was 103.1%.residue中图分类号：S859.84Keywords：chicken; liquid chromatography-mass spectrometry hybrid technology; ciprofloxacin; spike recovery rate; 本研究参照《动物源性食品中14种喹诺酮药物残留检测方法 液相色谱-质谱/质谱法》（GB/T 21312— 2007）[1]，对检验细节进行进一步细化及改进，使检验结果更准确稳定，适合肉类食品中环丙沙星残留量的准确检测、定量。村部环境保护科研监测所。0.2 mol·L-1磷酸氢二钠溶液配制：称取71.63 g磷酸氢二钠，用水溶解，定容至1 000 mL。0.1 mol·L-1柠檬酸溶液配制：称取21.01 g柠檬酸，用水溶液，定容至1 000 mL。Mcllvaine缓冲溶液配制：将1 000 mL 0.1 mol·L-1柠檬酸溶液与625 mL 0.2 mol·L-1磷酸氢二钠溶液混合，必要时用盐酸或氢氧化钠调节pH至4.0±0.05。EDTA-Mcllvaine缓冲溶液配制：称取60.6 g EDTA-2Na加入1 625 mL Mcllvaine缓冲溶液中，振摇使其溶解。1　材料与方法1.1　试剂甲醇、乙腈、甲酸，均为质谱级试剂；氢氧化钠、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na），均为分析纯试剂；环丙沙星标准品，含量为100 μg·mL-1，购自农业农作者简介：杨晓磊（1983—），男，本科，工程师；研究方向为食品安全。194/现代食品XIANDAISHIPINCopyright©博看网 www.bookan.com.cn. All Rights Reserved.󰀡盐酸环丙沙星标准溶液配制：吸取甲醇中盐酸环丙沙星溶液标准样品0.80 mL置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶液并定容至刻度，其环丙沙星浓度为 7.207 μg·mL-1。将上述溶液分别吸取0.347 mL、 0.694 mL于50 mL棕色容量瓶中，0.520 mL、0.694 mL、0.867 mL、1.041 mL、1.301 mL、1.735 mL于25 mL棕色容量瓶中，用初始流动相[甲醇-乙腈（40+60）∶0.2%甲酸水=10∶90]混匀定容至刻度。该标准工作液浓度分别为50.01 μg·L-1、100.03 μg·L-1、149.90 μg·L-1、 200.06 μg·L-1、249.93 μg·L-1、300.09 μg·L-1、 375.05 μg·L-1和500.16 μg·L-1。1.2　仪器与设备液相色谱质谱联用仪LCMS-8030（日本岛津公司）；电子天平AL204-IC[梅特勒托利多仪器（上海）有限公司]；酸度计FE20（梅特勒-托利多仪器有限公司）；超声波清洗器KQ-500DE（昆山市超声仪器有限公司）；无油真空泵H50BE-180[上海人民电机集团（国际）有限公司]；离心管振摇混匀器 （Multi Reax Heidolph instrument GmbH &Co KG）；氮吹仪TTL-DC11（北京同秦联）；高速离心机（Avanti J-E 贝克曼库尔特）；手动固相萃取仪W-SPE24（莱博秦科）。1.3　样品前处理1.3.1　环丙沙星提取样品采用的是鸡肉冻干粉质控样，分别称取5.006 8 g 和4.725 6 g复原后样品于50 mL的离心管中，均加入20 mL EDTA-Mcllvaine缓冲溶液，在2 040 r·min-1涡旋混匀10 min，观察离心管内样品是否充分分散混匀，可采用手动强烈振摇并分散后重新涡旋混匀10 min。将离心管超声提取10 min后，分别对离心管称重，并用EDTA-Mcllvaine缓冲溶液调至重量偏差＜0.01 g，静置，10 000 r·min-1离心5 min，将上清液倒至空50 mL聚丙烯离心管中，5 ℃低温条件保存（第1次提取）。重复第1次提取的步骤，将上清液倒入同一50 mL聚丙烯离心管中，对所有合并前两次提取液的离心管配平精确至0.01 g，10 000 r·min冷冻离心10 min，将上清液倒入100 mL锥形瓶中，用封口膜密封，5 ℃低温条件保存（第2次提取）。重复第2次提取的步骤，将上清液倒入100 mL锥形瓶中，并用6 mL EDTA-Mcllvaine缓冲溶液分3次润洗离心管，并将润洗液倒入对应的100 mL锥形-1Analysis󰀡and󰀡Testing分析检测瓶中，用封口膜密封，5 ℃低温条件保存（第3次提取）。1.3.2　净化方法采用HLB固相萃取柱（200 mg，6 mL），使用前先用6 mL甲醇洗涤和6 mL水活化。将锥形瓶中的提取液以2～3 mL·min-1的速度过柱，弃去滤液，用2 mL 5%甲醇水溶液淋洗，弃去淋洗液，将小柱抽干，用12.0 mL甲醇洗脱并收集洗脱液。洗脱液用氮气吹干，用5 mL 0.2%甲酸水溶液溶解，2 040 r·min-1涡旋混合5 min，超声10 min，再涡旋混合5 min，过0.22 μm有机滤膜，用于上机测定。1.3.3　复溶采用0.2%甲酸水溶液复溶，过程中涡旋应保证该水溶液能够完全覆盖洗脱液所停留的最大液位，在超声的过程中同时振摇，有利于提高其提取效率。1.3.4　加标回收样称取1.251 3 g鸡肉粉，利用3倍水复原，加入1 mL 浓度为149.90 μg·L-1的标准溶液（即添加149.90 ng 环丙沙星至样品中），加入的标准溶液量计入3倍复原水的量中，加标样品加水后，2 040 r·min-1涡旋 10 min，使样品达到均一性。将加标样品在2～8 ℃低温环境下避光放置过夜，能够使加标回收样最大限度地模拟实际阳性样品。第二天加标回收样与样品同时进行检验，以确保检验的平行性和有效性。1.4　仪器参数与测定1.4.1　高效液相色谱条件①色谱柱：Shim-pack FC-ODS 150×2 mm。②流动相：A（40+60甲醇-乙腈溶液），B（0.2%甲酸水溶液）；梯度淋洗液，梯度条件见表1。流速 0.2 mL·min-1，柱温40 ℃。③进样体积5 μL。表1　梯度条件表时间/min0699.510.51115甲醇-乙腈/%10305010010010100.2%甲酸水/%9070500090901.4.2　质谱条件电离模式：电喷雾电离正离子模式（ESI+）；质谱扫描方式：多反应监测（MRM），其他质谱参数见表2。XIANDAISHIPIN现代食品/195Copyright©博看网 www.bookan.com.cn. All Rights Reserved.分析检测Analysis and Testing表2　环丙沙星主要质谱参数表化合物环丙沙星母离子332.20子离子314.10288.20驻留时间/ms100.0100.0Q1电压/V-13.0-10.0碰撞能量-20.0-19.0Q3电压/V-22.0-20.02　结果与分析2.1　固相萃取小柱洗脱经比对，用6 mL甲醇洗脱会有待检成分无法完全洗脱的情况，造成标准曲线不准，无法准确定量的现象。当增加洗脱液的体积达到一定量后，所洗脱下来的目标物质的线性满足检验要求。经比较洗脱液体积为12 mL时标准曲线重现性已满足要求，如图1、图2所示。图1　12 mL洗脱液洗脱效果图图2　18 mL洗脱液洗脱效果图196/现代食品XIANDAISHIPINCopyright©博看网 www.bookan.com.cn. All Rights Reserved.󰀡2.2　检验过程中的基质效应基质效应的产生及强度大小主要与待测物本身的极性及浓度、选用的样品前处理方法、样品基质来源及成分、色谱分析条件与离子源结构等多种因素有关。其中，样品前处理方法的选择直接影响基质效应的强度，提取净化好的方法，基质成分含量少，基质效应会减小，否则会放大基质效应。上样前对样品进行浓缩或增加进样体积，都会使基质效应加强。通常情况下，研究者在建立检测方法时，往往忽略了不同来源Analysis󰀡and󰀡Testing分析检测的样品来自于不同个体、不同地方，个体间及地区间样品的差异会引起不同的基质效应。在常采用的反相色谱分离过程中，基质效应主要产生于分析的前段时间。因此，实际检测时应通过调整色谱条件使待测物尽量延后出来，与快速流出的强极性基质成分分开。流动相的组成及流速、进样体积也可影响基质效应。通常说来，流速越小、进样量越小，引起的基质效应越小[2]。加基质与不加基质标曲的区别，如表3、4、5所示。浓度/ng·mL-110.79744.93268.874107.147标准品浓度/ng·mL-110.00250.01674.952100.034表3　不加基质标曲数据结果表序号1234保留时间/min8.8208.8418.8208.796峰面积188 6741 045 3431 6 1792 606 686表4　加基质标曲数据结果表序号1234保留时间/min8.7088.7048.6948.683峰面积247 1581 513 7572 499 3563 323 195浓度/ng·mL-111.338.05476.626100.509标准品浓度/ng·mL-110.00250.01674.952100.034表5　加基质与不加基质标曲的对比表标准品浓度/ng·mL-1105075100不加基质标曲（峰面积）188 6741 045 3431 6 1792 606 686加基质做标曲（峰面积）247 1581 513 7572 499 3563 323 195峰面积比值/%131145152127表5数据为用1 mL复溶液复溶时的数据。可以看出，环丙沙星检验过程存在基质效应。基质效应有信号抑制或者增强两种情况。表5显示情况为基质增强效应。为避免上述基质效应，本实验采取以下措施：①在进样液代表性及进样器精度允许的范围内减少进样体积。②在选取阴性样品时，应尽量选择与被测物同种类、同部位且最好同地域的阴性样品作为空白基质。③在设置流动相时采用梯度洗脱方式延后目标物质的分离时间。2.3　环丙沙星含量计算和方法回收率由表9数据可知，加标样品（预先加标准品150 ng 涡旋、混匀、静置过夜）检出浓度为79.238 μg·L-1， 即5 mL进样液中含有396.19 ng环丙沙星。根据表6、表7、表8数据计算样品中的环丙沙星含量为 48.26 μg·kg-1，因此5.005 2 g样品中含有241.55 ng环丙沙星。测得加标样品中人为添加的环丙沙星的添加量为154. ng。所以本次实验的回收率为103.1%。表6　环丙沙星标准曲线表序号12345678浓度/ng·mL-110.00320.03029.98040.07050.01660.10674.952100.034峰面积326 577514 407754 485969 8381 287 7391 496 9411 813 0802 410 306XIANDAISHIPIN现代食品/197Copyright©博看网 www.bookan.com.cn. All Rights Reserved.分析检测Analysis and Testing表7　样品1的结果数据表序号12名称环丙沙星定量环丙沙星定性离子对332.20>314.10332.20>288.20保留时间/min8.08.612表8　样品2结果数据表序号12名称环丙沙星定量环丙沙星定性离子对332.20>314.10332.20>288.20保留时间/min8.68.632峰面积1 137 70865 238峰高79 1065 433浓度/ng·mL-145.63763.246峰面积1 200 04170 035峰高83 5635 696浓度/ng·mL-148.29267.847表9　环丙沙星样品加标回收数据表序号12名称环丙沙星定量环丙沙星定性离子对332.20>314.10332.20>288.20保留时间/min8.7738.765峰面积1 926 45986 135峰高182 3419 584浓度/ng·mL-179.23883.2923　结论通过鸡肉冻干粉检验环丙沙星的过程中，需要系统的考量样品的均一度、溶液配制、pH值、温度控制、杂质分离、质谱方法优化和基质效应等各种因素。食品检验每一个环节均需要严格把控，任何一个细节都会对检验结果的准确性造成不可估量的影响。本实验通过对检验细节的进步分解细化，使实验操作的可控性和数据的稳定性得到了进一步的提高。参考文献：[1]国家质量监督检验检疫总局.食品安全国家标准 动物源性食品中14种喹诺酮药物残留检测方法 液相色谱-质谱/质谱法：GB/T 21312—2007[S].北京:中国标准出版社，2007.[2]王立琦，贺利民，曾振灵，等.液相色谱-串联质谱检测兽药残留中的基质效应研究进展[J].质谱学报，2011（6）：323-325.（上接第193页）物，使目标菌落形成特定的颜色和形态，从而使目标菌与干扰菌有效地区分出来[5]。参考文献：[1]中国合格评定国家认可委员会.能力验证规则：CNAS-RL02：2018[S].2018-03-01.[2]中华人民共和国卫生部.食品安全国家标准 食品微生物学检验 志贺氏菌检验：GB 47.5—2012[S].北京：中国标准出版社，2012.[3]鲁佳琦，张乐，罗中魏，等.食源性志贺氏菌的研究进展[J].食品安全导刊，2020（15）：15.[4]刘杰，赵满仓，周海峰.VITEKⅡ全自动微生物分析系统应用问题分析[J].中国医疗设备，2013，28（9）：119-121.[5]王建昌，陈志敏，李静，等.4种分离培养基检测志贺氏菌效果比较[J].中国酿造，2014，33（3）：113-116.3　结论（1）做好实验前期准备工作，确定检测方法与实验方案。把实验所涉及的试剂进行排查；按思路整理整个实验流程，便于实验操作时记录每天实验完成情况。（2）测试样品要严格按照《参试指导书》和国标GB 47.5-2012进行检测。在志贺氏菌增菌培养中41.5 ℃厌氧培养尤为重要，在此环境中可排除需氧菌、兼性厌氧菌和部分不耐热厌氧菌的干扰。（3）标准菌株最好在营养琼脂复壮再选择性平板划线使用。在本次实验中，从磁珠冻存管挑出的磁珠在XLD平板上生长不佳或无菌株生长。标准菌株要反复传代2～3次，尽量使菌群处于对数生长期[4]。（4）显色培养基的使用也是实验过程中节省人力、财力和时间的有效方法。因培养基添加的显色底198/现代食品XIANDAISHIPINCopyright©博看网 www.bookan.com.cn. 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