水相酶解结合溶剂萃取生产花椒籽油工艺研究
吴珺婷;秦礼康;金毅;邓婷;闵方卿
【摘 要】Using from the organic solvent extract grease liquid of Hua-jiao seed from the enzymatic solution, the results showed that the enzyme solution were handled by hexane liquid couid fully separate out, and proposed grease solvent residual less, solvent could he recycled.
Composite enzyme treatment of Huajiao seed oil efficiency was superior to single enzyme. Considering the economic costs, plus enzyme Quantity selection cellulose enzyme (0. 5%) and neutral protease (7%);Solid-liquid ratio to the highest rate when oil was 1:5 (m:V) , showed that in these conditions zymolysing most fully, and screening enzyme time for 4 h best.%采用水相酶解及有机溶剂萃取工艺生产花椒籽油.结果表明,得油率最高的优化工艺参数:纤维素酶和中性蛋白酶添加量分别为0.5％和7％,固液比1 ∶ 5(m∶V),酶解时间4h.该法游离油得率最高可达69.84％,毛油品质较好,有实际运用价值. 【期刊名称】《食品与机械》 【年(卷),期】2012(028)002 【总页数】5页(P126-130) 【关键词】花椒;花椒籽油;水酶法
【作 者】吴珺婷;秦礼康;金毅;邓婷;闵方卿
【作者单位】贵州大学生命科学学院,贵州贵阳550025;贵州大学生命科学学院,贵州贵阳550025;贵州大学生命科学学院,贵州贵阳550025;贵州大学生命科学学院,贵州贵阳550025;贞丰县顶罈椒业有限公司,贵州贞丰562201 【正文语种】中 文
顶坛花椒 （Zanthoxylum planispinumvar.dintanensis）是竹叶椒变种，广泛栽培于贵州省贞丰县北盘江喀斯特河谷地区，迄今已有数百年的栽培历史，香味及口感独特，以“香味浓、麻味重、产量高”而著称［1，2］。顶坛花椒果实采收后，果皮常作烹饪调料和中药配料，可制成上好的花椒油，余下的为黑色有光泽的花椒籽［3］，约占花椒果实总重量1/2，长期以来却因无有效方式利用作为农业废弃物直接丢弃。经分析，花椒籽中油脂含量为15%～27%，其脂肪酸组成中90%为不饱和脂肪酸，而人体必需脂肪酸亚油酸和亚麻酸含量达45%以上［4，5］。因此，花椒籽油是生产保健食用油的理想原料。
目前，花椒籽油的提取方法主要有压榨法、溶剂浸出法及超临界CO2萃取［6－8］等。水酶法提油工艺是一种新兴的提油方法，该法以机械和酶解为手段降解植物细胞壁，使油脂得以释放，达到提取油脂的目的。与传统工艺相比，具有温和的处理条件、所提取的油纯度高、色泽浅、酸值及过氧化物值低、操作时能耗低、污染少等优点。目前水酶法已应用于多种油料的提取［9－12］，但对于以水酶法提取花椒籽油还未见相关报道。本试验采用水相酶解有机溶剂萃取法生产花椒籽毛油，从生产工艺、油脂品质及经济成本等三方面与超临界CO2萃取法、螺旋压榨法和液压法进行了比较，为进一步提高花椒籽综合利用及花椒籽油工艺改进提供理论依据。 花椒籽：为贵州省贞丰县北盘江喀斯特河谷地区成熟顶坛花椒，采摘后进行壳籽分离，并于常温避光保存。
碱性蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶：南京庞博生物工程有
限公司。
试验所用试剂：均为分析纯。
旋转蒸发器：RE－5866A型，上海雅蓉生化设备仪器有限公司； 高速万能粉碎机：FW100型，天津市泰斯特仪器有限公司； 电热恒温鼓风干燥箱：101A－2B型，上海锦昱科学仪器有限公司。 1.3.1 工艺流程
样品→破碎→加入蒸馏水→沸水浴灭酶→冷却调pH→加酶→水浴酶解→冷却→破乳→3 500r/min离心10min→分离得上层液→旋转蒸发→得油并记录数据 1.3.2 原料制备 对花椒籽进行自然晾晒、初选、粉碎（20目）、（80±1）℃烘干后（水分＜10%），于干燥器中冷却，避光处室温密闭贮藏备用。
1.3.3 试验设计 采用常规水酶法花椒籽酶解液进行水油分离对比试验后，在相同加酶量下比较破碎方法、单一酶种与复合酶种对花椒籽游离油提取率的影响。为确定影响花椒籽籽游离油得率的主要因素，对酶种类及酶浓度、pH、固液比、酶解时间进行单因素试验，并以游离油得率为评定指标。 1.4.1 游离油得率 花椒籽游离油得油率按式（1）计算。 1.4.2 花椒籽品质分析
（1）含油率：NY/T 1285——2007《油料种籽含油量的测定 残余法》； （2）水分及挥发物：GB/T 144.1——2008《油料 水分及挥发物含量测定》； （3）蛋白质：GB/T 5009.5——2003《食品中蛋白质的测定》； （4）灰分：GB/T 5009.4——2003《食品中灰分的测定》；
（5）纤维素：GB/T 5515——2008《粮油检验 粮食中粗纤维素含量测定 介质过滤法》。
1.4.3 油脂品质分析
（1）透明度、气味、滋味检验：SN/T 0801.9——1999《进出口动植物油脂 透
明度、气味、滋味检验方法》；
（2）水分及挥发物检验：GB/T 5528——2008《动植物油脂 水分及挥发物含量测定》；
（3）不溶性杂质检验：GB/T 15688——2008《动植物油脂 不溶性杂质含量的测定》；
（4）酸值检验：GB/T 5534——2008《动植物油脂 酸值和酸度测定》； （5）碘值检验：GB/T 5532——2008《动植物油脂 碘值的测定》； （6）磷脂检验：GB/T 5537——2008《粮油检验：磷脂含量的测定》； （7）皂化值检验：GB/T 5534——2008《动植物油脂 皂化值的测定》； （8）维生素E检验：NY/T 1598——2008《食用植物油中维生素E组分和含量的测定 高效液相色谱法》。 数据采用SPSS 16.0统计软件分析。
由表1可知，本试验中所采用花椒籽含油率为16.05%，且花椒籽的纤维素和蛋白质含量偏高，可以优先选择纤维素酶和蛋白质酶进行酶解试验。
筛选脱壳花椒籽经粉碎机粉碎后按一定固液比加入蒸馏水，85℃灭酶10min，冷却至室温后加入0.05mol/L柠檬酸缓冲液调节至酶最适pH值，匀成浆料后按一定的m（酶）∶m（籽）（干基计）加入酶制剂，50℃下酶解一定时间，破乳后3 000r/min离心后得到游离油、乳状液、水解液及渣。
本试验以常规水酶法工艺酶解花椒籽后，酶解分离仅获得少量油及大量乳状液。乳状液采用13 000g高速离心、超声波、反复冻融法及调节pH值破乳，但均无法完成油水分离，故采用有机溶剂从酶解液中提取油脂。比较有机溶剂无水乙醇、无水乙醚、石油醚、正己烷、乙酸乙酯提取酶解液效果，由图1可知，酶解乳状液经正己烷处理析出情况较好，游离油得率达到42.60%。
选择正己烷作为提油溶剂，通过反复的验证试验，确定了本试验水相酶解有机溶剂
萃取工艺流程为筛选花椒籽，去除杂质，粉碎（60目）后按固液比1∶4（m∶V）搅匀成浆，沸水浴1h灭酶，冷却后调节至最适pH值，加酶后在水浴中50℃加热酶解一定时间（120r/min搅拌）；冷却后加入正己烷150mL继续搅拌10min，3 500r/min离心10min，上层清液经旋转蒸发后得毛油。
2.3.1 花椒籽破碎方法对游离油得率的影响 油料的破碎方法分为干碾压法和湿研磨法。一般而言，对于初始水分含量较高的油料种籽（如可可籽），常采用湿法破碎；对于花生，湿法破碎的结果是产生非常稳定的乳状液，从而影响游离油提取的工艺难度。由于花椒籽初始水分含量约为11%，采用干法破碎较为合适，这样既可以减少能耗又可以在一定程度上避免破碎过程中形成稳定的乳状液。
2.3.2 酶的种类对得油率的影响 储存在油料细胞内部的油脂，通常同蛋白质和碳水化合物等大分子结合，构成如脂多糖、脂蛋白等复合体［13］。只有通过破坏油料组织的油脂复合体及细胞结构，才能获得其中的油脂。通过机械破碎，结合对油料组织以及脂多糖、脂蛋白等复合体有降解作用的酶处理油料的方法更易于提取植物油料中的油脂成分。酶能破坏细胞壁，对油料组织中的脂蛋白及脂多糖有分解作用，也可增加油料组织中油的流动性达到提高出油率的目的。酶法提油中常采用的酶类主要有：纤维素酶（CE）、半纤维素酶（HE）、蛋白酶（PR）、果胶酶（PE）、α－聚半乳糖醛酸酶（α－PG）、α－淀粉酶（α－AM）、β－葡聚糖酶（β－GL）等［11］。
在固定酶反应条件前提下，分别比较α－淀粉酶、果胶酶、菠萝蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、纤维素酶在单一酶酶解花椒籽对游离油得率的影响。反应条件为加酶量1%，固液比1∶6（m∶V），酶解温度50℃，pH 7.0，时间4h，结果见图2。由图2可知，对比未添加酶试验，添加α－淀粉酶、菠萝蛋白酶、果胶酶对花椒籽提油率没有显著影响。而酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、纤维素酶添加后游离油得率较其余3种酶增加明显，其中纤维素酶的游离油
得率为9.5%。
一般情况下，复合酶系的作用效果优于单一酶，油脂得油率会显著提高［14］。单一的酶对提高游离油得率作用有限。试验将多种酶的单一使用效果和复合使用效果进行对比，选取最适合于提取花椒籽油的酶的种类。参考文献［15］，在前期大量预试验基础上，采用纤维素酶为主，复配其它蛋白酶的组合对花椒籽进行水酶法提油试验。
2.4.1 中性蛋白酶和纤维素酶的复合效果 固定纤维素浓度为0.5%，分别添加5%的α－淀粉酶、果胶酶、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶和中性蛋白酶，反应条件为固液比1∶6（m∶V），酶解温度50℃，时间4h，pH 7.0，结果见图3。由图2和图3可知，添加复合酶能有效提高游离油得率。其中作用最明显的是中性蛋白酶和纤维素酶，游离油得率达到50.39%。分析原因，花椒籽含有较多的蛋白质和纤维素，这两种酶的添加能够有效地破坏细胞壁的纤维素及与脂类结合的蛋白结构，从而充分的释放细胞壁中的油脂。α－淀粉酶、果胶酶、菠萝蛋白酶与纤维素酶复合效果明显低于其余3种酶，可能与花椒籽粉碎后的结构有关，有待进一步分析。
2.4.2 中性蛋白酶的浓度对游离油得率的影响 固定纤维素酶浓度为0.5%，增加中性蛋白酶浓度，反应条件为固液比1∶6（m∶V），酶解温度50 ℃，时间4h，pH 7.0，结果见图4。
由图4可知，随着酶浓度增加，游离油得率也逐渐增加。说明加酶量越大，蛋白质的解离程度越彻底，油更易释放。加酶量为1%～5%时，游离得油率缓慢上升，当加酶量超过7%（V∶m）时，游离得油率增加缓慢，因此选择中性蛋白酶浓度为7%（V∶m）。
2.4.3 纤维素酶的浓度对游离得油率的影响 固定中性蛋白酶浓度为7%，增加纤维素酶浓度，反应条件为固液比1∶6（m∶V），酶解温度50℃，时间4h，pH 7.0，
结果见图5。由图5可知，随着纤维素酶浓度增加，游离油得率也逐渐增加。说明加酶量越大，纤维结构被破坏的程度越彻底，油更易释放。当加酶量超0.5%（V∶m）时，游离油得率增加缓慢，因此选择纤维素酶浓度为0.5%（V∶m）。 2.4.4 pH对游离油得率的影响 固定纤维素酶和中性蛋白酶加酶量，研究pH值变化对游离油得率的影响，反应条件为纤维素酶0.5%，中性蛋白酶7%，固液比1∶6（m∶V），酶解温度50℃，时间4h，结果见图6。pH影响蛋白质的溶解度，蛋白质的溶出可提高游离油得率，为使蛋白酶能充分作用，必须通过提高pH值增大蛋白质溶解量。本试验选用了纤维素酶和中性蛋白酶，根据所选酶的种类确定酶解时的pH，pH的选择应在酶的最适pH范围内，使酶和底物反应充分。纤维素酶的最适pH值为3.8～7.0，中性蛋白酶的最适pH值为7.0～8.0。从图6可看出，pH 7.0的游离油得率达到最大。
2.4.5 固液比对游离油得率的影响 固定下列条件，纤维素酶0.5%，中性蛋白酶7%，固液比1∶6（m∶V），酶解温度50℃，时间4h，研究固液比对游离油得率的影响。由图7可知，当固液比为1∶5（m∶V）时游离油得率最高，表明在此条件下酶解最为充分。
2.4.6 酶解时间对游离油得率的影响 由图8可知，酶解4h前，随着反应时间的延长，游离油得率明显增加；4h后游离油得率增长缓慢。由于反应时间过长会影响油的品质，因此选定复合酶作用时间为4h。综上所述，纤维素酶和中性蛋白酶的最适酶解条件：固液比为1∶5（m∶V），于50℃，pH 7.0下添加0.5%（V∶m）纤维素酶和7%中性蛋白酶（V∶m），酶解4h。
目前水相酶解结合溶剂萃取制得花椒籽毛油的游离油得率最高可达69.84%（原料含油率16.05%）。通过以上试验，对制备花椒籽油的工艺条件有了初步研究，在本试验的下一阶段工作中将对水相酶解结合溶剂萃取制备花椒籽油进行工艺优化研究。
在试验室采用水相酶解有机溶剂萃取法、超临界CO2结合夹带剂（无水乙醇）萃取法、螺旋榨油法、液压榨油法分别以最优条件［16］对花椒籽进行压榨制得毛油，并进行油脂品质分析与比较，结果见表2。
超临界CO2萃取法、水相酶解有机溶剂萃取法、液压法3种工艺油碘价相差不大。仅超临界CO2萃取油中检出VE（0.13mg/100g）；同超临界CO2 萃取油相比，液压法制得花椒籽油的酸价、过氧化值、皂化价和酸价偏高，其他品质指标均较接近，总体品质较好。水相酶解有机溶剂萃取法的酸价、过氧化值和磷脂最高，皂化价偏低，有轻微溶剂残留气味，品质较差。螺旋压榨法提取油出油率极低，品质最差，无法作为食用油使用。
（1）高速离心、超声波、反复冻融法及调节pH值法难以提取出花椒籽酶解液中的油脂。采用有机溶剂从酶解液中提取油脂，结果表明酶解液经正己烷处理能完全析出，且所提油脂溶剂残留较少，溶剂可回收重复使用。
（2）复合酶处理花椒籽提油效率优于单一酶，选用纤维素酶＋中性蛋白酶酶解花椒籽结合溶剂萃取法提取花椒籽油高于其它组合。加酶量选择纤维素酶（0.5%）和中性蛋白酶（7%）；固液比1∶5（m∶V）时得油率最高，表明在此条件下酶解最充分；经筛选酶解时间为4h最佳。
（3）水相酶解有机溶剂萃取工艺流程：筛选花椒籽，去除杂质，粉碎（60目）后按固液比1∶5（m∶V）搅匀成浆，沸水浴1h灭酶，冷却后调节至酶最适pH值，加酶后在水浴中加热酶解4h（120r/min搅拌）；冷却后加入正己烷150mL继续搅拌10min，3 500r/min离心10min，上层清液经旋转蒸发后得毛油。 （4）超临界CO2结合夹带剂萃取青花椒籽油，食用品质最佳，但成本较高，其工业应用的经济可行性低。水相酶解有机溶剂萃取毛油品质较佳，游离油得率试验中最高可达69.84%（原料含油率16.05%），油脂品质较优，可进一步改进酶解能力、提油方法及后期精炼工艺以提高出油量和油质，具有较大的改进空间，对花
椒籽制油及水酶法工艺研究具有一定的参考价值。
【相关文献】
1 屠玉麟.顶坛花椒营养成分及微量元素测试研究［J］.贵州师范大学学报：自然科学版，2000，18（4）：31～36.
2 龙成昌，陈训.花江峡谷地区顶坛花椒生长状况与土壤条件相关分析［J］.贵州师范大学学报：自然科学版，2003，21（3）：102～104.
3 林进能.天然香料生产与应用［M］.北京：轻工业出版社，1991.
4 李桂华，付黎敏，薛开发.花椒种籽化学成分分析研究［J］.郑州粮食学院学报，1994，15（5）：17～19.
5 樊经建.花椒，花椒叶芳香油及花椒油的成分分析［J］.中国油脂，1992（1）：32～34. 6 李大房，马传国.水酶法制取油脂研究进展［J］.中国油脂，2006，31（10）：29～31. 7 钱俊青，谢祥茂.酶法提取植物油的工艺方法及特点［J］.中国油脂，2003，28（4）：14～16. 8 Purcell A W，Zhao G L，Aguilar M I，et al.Comparison between the isocratic and gradient retention behavior of polypeptides in reversed－phase liquid chromatogrpahic environments［J］.J.Chromatogr，A，1999，852（l）：43～46.
9 冷玉娴，许时婴，王璋，等.水酶法提取葵花籽油的工艺［J］.食品与发酵工业，2006，32（10）：127～131.
10 陈晶.水酶法提取亚麻籽油及其微胶囊化［D］.无锡：江南大学，2007. 11 盛小娜.水酶法提取甜杏仁油及水解蛋白的研究［D］.无锡：江南大学，2008.
12 江利华，华娣，王璋，等.水酶法从花生中提取油于水解蛋白的中试研究［J］.食品与发酵工业，2009，35（9）：147～150.
13 李汴生，彭志英，宁正祥.植物油料取油的酶预处理工艺［J］.中国粮油学报，1997，12（6）：24～30.
14 章绍兵.水酶法从油菜籽中提取油和生物活性肽的研究［D］.无锡：江南大学，2008. 15 王瑛瑶，王璋.水酶法从花生中提取水解蛋白与油－酶解工艺参数［J］.无锡轻工大学学报，2003，22（4）：60～.
16 吴珺婷，秦礼康，金毅，等.超临界CO2及夹带剂萃取顶坛花椒籽油工艺优化［J］.中国油脂，2011，36（4）：16～19.
