同样采用Ni-NTA His结合树脂亲和纯化重组目的蛋白，
1、200mL菌液离心收集大量诱导的菌体，并用1×PBS缓冲液洗涤两次。
2、将保存的菌体沉淀用总体积为20mL的1×Bind Buffer (300mM NaCl，50MmNaH2PO4; 10mM imidazote,pH8.0)重悬，在冰浴中超声波破菌至溶液呈白色澄清。
3、4℃12,000rpm离心30分钟，然后用20mL的包涵体洗涤Buffer (50mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，0.5% Triton x-100，pH8.0)洗涤沉淀两次。
4、加20mL的包涵体溶解Buffer〔50mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，8mol/L Urea，pH8.0〕充分溶解，〔旋涡溶解，最好溶解时间长一点，1h左右，也可以用冰盒装放摇床上1h〕，4℃10,000 r/min离心30min，收集上清。 亲和层析纯化表达的蛋白
pQE40和pET-32a(+)载体表达的蛋白C﹑N端均融合了6个组氨酸的tag，可用金属螯和层析纯化，也可用抗6个组氨酸的单克隆抗体检测表达蛋白的正确性。根据表达蛋白的溶解情况分两种方法对蛋白进展纯化。 天然条件下纯化可溶形式的目的蛋白
目的蛋白的表达和收获：用3.2.2.1所述的方法大量表达目的蛋白。4℃下10,000 rpm离心5min弃上清，向细菌沉淀中参加4℃用冰预冷的1×Ni-NTA结合缓冲液(50 mmol/L NaH2PO4, 300 mmol/L NaCl, 10 mmol/L咪唑, pH8.0)，每100mL培养液参加4mL结合缓冲液，重悬菌体。－40℃冷冻，室温溶解，反复冻融三次。再在冰水浴中超声10min(超声10s, 间隔10s)，破碎菌体。4℃下10,000 rpm离心20min，保存上清液。
Ni-NTA His·Bind resin的准备：将树脂充分重悬，取4mL悬液(每2mL树脂悬液可吸附5-10 mg蛋白)加到10mL沉降柱(gravity column)中，树脂自然沉降后，加1×Ni-NTA结合缓冲液洗两次。
目的蛋白的吸附和洗脱：将菌体上清液加到处理好的树脂中，4℃轻柔混匀，结合2h。树脂自然沉降后，翻开沉降柱下端的管帽，让缓冲液缓慢流出。液体流完后，加1×Ni-NTA漂洗缓冲液(50mmol/L NaH2PO4,300mmol/L NaCl, 20mmol/L咪唑，pH8.0)5mL，轻柔混匀，漂洗两遍。结合、漂洗过程中收集上清100 μL，以备电泳分析。然后加1×Ni-NTA洗脱缓冲液(50mmol/L NaH2PO4, 300mmol/L NaCl,pH8.0，咪唑浓度分别为100、
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200、300、500、750和1000 mmol/L)，按照咪唑浓度由低向高洗脱并收集目的蛋白，每0.5 mL收集一管。SDS-PAGE电泳分析各管收集液，合并有目的蛋白的收集液。 变性条件下纯化包涵体形式的目的蛋白
1、包涵体的纯化：收集的菌体按每100 mL培养基所得菌体参加20 mL 1×变性结合缓冲液(0.1mol/L NaH2PO4，0.01mol/L Tris-Cl,pH8.0,不含尿素)冰浴30min，按前述方法进展超声，重悬菌体。5,000×g离心15min，包涵体和细胞碎片位于沉淀中。移去上清，将沉淀重悬于20mL 1×变性结合缓冲液，重复上述步骤。移去上清，按每100 mL培养基加5mL缓冲液的比例，参加含8 mol/L尿素的1×变性结合缓冲液重悬沉淀。冰浴孵育1h，彻底溶解包涵体。16,000×g离心30min去除不溶成分。
Ni-NTA His·Bindresin的准备、目的蛋白的吸附和洗脱方法同前。1×变性漂洗缓冲液(8 mol尿素，0.1 mol/L NaH2PO4,0.01 mol/L Tris-Cl, pH6.3)漂洗两遍后，参加pH5.9的1×变性洗脱液(8 mol/L尿素，0.1 mol/L NaH2PO4,0.01 mol/L Tris-Cl)0.5mL洗两遍，再用pH4.5的1×变性洗脱液洗脱并收集目的蛋白，每0.5mL收集一管。结合、漂洗过程中收集上清100μL，以备电泳分析。SDS-PAGE电泳分析各管收集液，合并有目的蛋白的收集液。
变性条件下目的蛋白的切胶回收
将变性条件下纯化的目的蛋白的收集液进展SDS-PAGE电泳，切胶回收。－20℃保存胶条。所有胶条放于研钵中，参加适量0.7%的生理盐水，研磨成很细的颗粒状，用1mL的针头可以吸入。电泳检测，估计蛋白浓度。 兔和小鼠多克隆抗体的制备
用作免疫的动物为日本大耳兔，体重2 kg左右，由病毒所动物饲养中心提供，按以下免疫程序来免疫。500ug纯化的pQE-40-MT-2和pET32a(+)-MT-2重组融合蛋白多点注射兔腘淋巴结和脚掌，每点注射0.2 mL。第一次注射2周后加强免疫2次，各次剂量为上次剂量的二分之一，每次间隔两周。第二次、第三次蛋白溶液背部皮下、脚掌多点注射。在第三次免疫2周后，自颈动脉抽取血液。将兔血37℃放置1h后再在4℃
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放置过夜，1500×g离心30 min，吸取上层的多抗血清，分装后于－70℃冻存。同时还用pET32a(+)-MT-2重组融合蛋白免疫了5只4周龄的雄性小鼠，每只每周一次皮下注射40ug，6周后眼球取血，小鼠抗体血清的处理方法和兔抗体血清的处理方法一样。 2.3免疫印迹检测鳜MT-2在各组织的分布
实验用鳜，体重为400 g左右，免疫前驯养一周。用于免疫印迹的器官包括鳃、肝脏、心脏、肾脏、肌肉、头肾、脑、脾脏和肠道。将所取的组织分别在MEB缓冲液〔100 mmol/L β-磷酸甘油，20 mmol/L HEPES，20 mmol/L EGTA，15 mmol/L MgCl2，pH 7.3，临用前参加1 mmol/L DTT，2 mmol/L PMSF，2.5 µg/mL leupetin，2.5 µg/mL aprotinin〕中匀浆，-40 ℃冻存。临用前将组织匀浆液14,000 rpm 4 ℃离心10min取上清，用于免疫印迹检测。
将预染Marker、纯化蛋白样品和含5ug蛋白的组织提取液经16.5% SDS-PAGE胶〔Bio-Rad Mini-Protein电泳系统〕别离，电泳条件：10mA 1 h，20mA 至电泳完毕。将电泳后胶板在转膜缓冲液〔25 mmol/L Tris pH8.3，192 mmol/L甘氨酸，30%甲醇〕中平衡20 min。按照伯乐半干电泳转移系统〔Trans-Blot SD semi-dry electrophoretic transfercell〕操作指南装配转膜系统，室温下以15V〔120-180mA〕转膜30min，将蛋白转移至甲醇浸润过的0.22 um的聚偏氟乙烯膜〔PVDF〕膜上。用TBS溶液〔10 mmol/L Tris-Cl pH7.5，150 mmol/L NaCl〕轻轻漂洗膜10 min，再用2.5%的戊二醛固定1 h，以防止蛋白在随后的洗膜和孵育中脱落。然后用TBS洗膜10min×3，再用5%脱脂奶粉〔溶于TBS中，含 0.05% Tween 20〕室温封闭2 h后，用5%脱脂奶粉〔溶于TBS中，含 0.05% Tween 20〕按1：500稀释一抗，一抗采用两种重组蛋白免疫产生的兔抗MT-2抗体，4 ℃封闭过夜，再用TBST洗膜10min×3。以1：1000的稀释比例参加碱性磷酸酶标记的山羊抗兔二抗室温孵育2h。用TBST溶液洗膜10min×3，每次10min，再用dd H2O洗膜10min。最后用NBT/BCIP浓缩显色试剂盒配置的底物溶液显色1-5min，滤膜置于dd H2O溶液中终止反响。
2.4免疫组织化学检测鳜MT-2的在细胞的分布 实验用鳜，体重为400 g左右，免疫前驯养一周。 石蜡组织包埋与切片
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1、取材与固定：迅速取肝脏和肾脏组织剪切成1.0×1.0×0.2厘米的小长条放入4%的多聚甲醛固定液中直接固定24h，4℃冰箱保存。 2、冲洗：固定以后，须在自来水下流水冲洗10分钟。
3、脱水：材料要切成薄片必须以石蜡包埋。为使石蜡能透入材料部，必须除去其部的水分。这种除去材料部水分的操作过程，称为脱水。脱水通常用酒精，必须渐进，不能急骤，否那么会引起材料不均匀的收缩。脱水时用70%、80%、90%、95%、100%各级酒精。每级10-30分钟。
4、透明：此时材料部浸满酒精，石蜡仍难渗入，必须用既能与酒精混合又能溶解石蜡的媒浸剂浸渍，本试验采用二甲苯。每次20-30分钟，进展2次，时间不能长，久浸会使材料变脆，造成切片困难。
5、浸蜡：指石蜡浸入材料部的操作过程。将溶解的石蜡倒入浸蜡杯，将透明好的组织放入，中间换二次蜡，每次20-30分钟，将温箱温度调到与石蜡熔点一样，如温度过高，包埋物变得硬脆，坚实不易切片。
6、包埋：将材料包埋在石蜡中以便于切片。将熔化的石蜡倒入包埋器中，用热镊子把材料迅速移入包埋器中，并摆好位置，观察面向下摆放。之后，将包埋器放置于水面，缓慢浸入水中。等石蜡完全凝结以后，从水中取出，并注明包埋物的编号和日期等。 7、切片：将材料连同周围的石蜡用解剖刀切修成梯形，四周距离材料1-2毫米，前端离材料宜近。用少许石蜡将蜡块固定在木块上。将有蜡块的木块固定在切片机上，并调节切片刀的固定器或材料固定器，使切片刀与蜡块靠近。调节切片厚度为4微米，进展切片，并将切片用毛笔移在铺有黑纸的盘中。每节蜡带不超过盖玻片的长度。
8、展片与贴片：将切好的蜡带，放入温度为40-50℃的水浴锅，根据蜡溶与水面的力，展平组织，取一小滴蛋白甘油涂在载玻片上，用小拇指外侧把它涂成薄层，涂抹面积要超过蜡片所用的面积，涂抹得越薄越均匀越好。用解剖针把蜡片段拖于载玻片上, 玻片45-50℃烘干。
9、脱腊：把玻片放入盛有二甲苯的染缸中，熔去石蜡〔3分钟〕，再经第二缸〔3分钟〕。 10、水化：经70%--80%--90%--95%各级酒精入水。 柠檬酸缓冲液煮沸抗原修复
1、石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS〔pH=7.4〕冲洗3次，每次3分钟〔3×3’〕。
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2、将组织切片浸泡于蒸馏水中待用。
3、取一定量的pH=6.0柠檬酸缓冲液于烧杯中，放在电炉上加热至沸腾。
4、将脱蜡水化后的组织切片至于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，煮20分钟。
5、烧杯离开火源冷却至室温，才能从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗2次，然后用PBS〔pH=7.4〕冲洗2次，每次3分钟。 免疫织化学染色
1、每切片加50ul过氧化酶阻断溶液〔试剂A〕，以阻断源性过氧化物酶活性，室温下孵育10分钟。
2、PBS冲洗3次，每次3分钟。
3、甩去PBS液，每片加50ul的非免疫性动物血清〔试剂B〕，室温下孵育10分钟。 4、甩去血清，每切片加50ul的稀释好的小鼠MT抗体〔抗体的稀释比为1：500〕，用非免疫血清代替一抗作为阴性对照，放入4℃冰箱过夜。 5、PBS冲洗3次，每次3分钟。
6、甩去PBS液，每切片加50ul的生物素标记的第二抗体，室温下孵育10分钟。 7、PBS冲洗3次，每次3分钟。
8、甩去PBS液，每加50ul链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液〔试剂D〕，在室温下孵育10分钟。
9、PBS冲洗3次，每次3分钟。
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10、甩去PBS液，每切片加100ul新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察3-10分钟，阳性显色为棕色。
11、自来水冲洗，木素复染。 12、0.1%HCl分化, PBS冲洗返蓝。
13、DAB显色后，切片经过梯度酒精脱水枯燥，二甲苯透明，滴加中性树胶后盖上盖玻片封固。
14、实验观察与拍照：切片完成后，可在显微镜下观察到正常肝、肾组织的染况并进展拍照。
柱纯化蛋白： 一、柱平衡：
5、加到用平衡缓冲液平衡好的Ni-NTA His Bind Resin柱子(Ni-NTA His Bind Resin柱子平衡按说明书)，混匀，收集流穿液；用含50mmol /L咪唑的洗脱Buffer〔50mM咪唑,50mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，8mol/L Urea，pH8.0〕洗脱杂蛋白，最后用含250mmol /L咪唑的洗脱Buffer〔250mM咪唑,50mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，8mol/L Urea，pH8.0〕洗脱目的蛋白。
将纯化的重组蛋白采取逐步降低尿素浓度的方法，透析除去蛋白溶液中的尿素，使变性的蛋白在此过程中自然复性。先用含6mol/L尿素的PBS缓冲液4℃ 透析过夜，然后分别用4.0、3.0、2.0、1.0、0.5mol/L的梯度透析各4h以上，最后用PBS缓冲液再透析4h以上。透析完毕后，将蛋白溶液在4℃于12,000r/min离心10min，上清即为可溶的复性蛋白，聚乙二醇8000浓缩，2ml离心管分装保存于-80℃冰箱。
Protein minipreps under denaturing conditions Materials
• Microcentrifuge tubes
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• Ni-NTA His•Bind Resin
• Buffers A–C, E (see page 27)
1. Transfer 1 ml bacterial culture to a microcentrifuge tube.
The amount of culture used depends on the protein expression level. One ml is sufficient if the protein is expressed at high rates (see Table 1, page 4). If lower expression rates are expected, larger volumes may be necessary.
If a time course of expression is being performed, take 1 ml samples of a larger culture at 30 min intervals after induction, collect the cell pellets and store them at –20°C until all the samples are ready for processing.
2. Harvest the cells by centrifugation for 1 min at 15,000 × g and discard supernatants.
If larger culture volumes are required, refill microcentrifuge tube and centrifuge. Repeat this step until all cells are harvested.
3. Resuspend cells in 200 μl buffer B. Lyse cells by gently vortexing, taking care to avoid frothing.
The solution should become translucent when lysis is complete. Most proteins are soluble in buffer B. If the solution does not become translucent, lyse cells with buffer A.
4. Centrifuge the lysate for 10 min at 15,000 × g to remove the cellular debris, and transfer the supernatant to a fresh tube.
5. Add 50 μl of a 50% slurry of Ni-NTA His•Bind Resin (25 μl resin has a capacity for 125-250 μg His•Tag fusion protein) to each tube, and mix gently for 30 min at room temperature.
6. Centrifuge 10 sec at 15,000 × g to pellet the resin, transfer 10 μl of the supernatant to a fresh tube, and discard the remaining supernatant. Store the supernatant samples on ice.
The supernatant samples will contain any proteins which have not bound to the resin. 7. Wash the resin with 2 × 250 μl of buffer C.
Centrifuge for 10 sec at 15,000 × g between each wash step and carefully remove the supernatant.
8. Elute the protein with 3 × 25 μl buffer E.
Centrifuge for 10 sec at 15,000 × g between each elution step and carefully remove the supernatant to a fresh tube.
9. Analyze the fractions by SDS-PAGE. If Buffer A was used to lyse the cells, refer to “Preparation of guanidine containing samples for SDS-PAGE〞, on page 27.
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