云南农业大学学报Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｙｕｎｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１５，３０（４）：５３５—５４０ ｈｔｔｐ：／／ｘｂ．ｙｎａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ Ｅ—ｍａｉｌ：ｘｂ＠ｙｎａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ ＩＳＳＮ １００４—３９０Ｘ；ＣＯＤＥＮ ＹＮＤＸＡＸ ＤＯＩ：１０．１６２１１／ｊ．ｉｓｓｎ．１００４－３９０Ｘ（ｎ）．２０１５．０４．００８ 马铃薯病毒ＰＶＹ，ＰＶＳ和ＰＬＲＶ 多重ＲＴ－ＰＣＲ检测水 黄 丹 ，余 琨 ，陈建斌 ，蔡 红 ，朱有勇 （１．云南农业大学植物病理重点实验室，云南昆明６５０２０１； ２．云南省建水县农业技术推广所，云南建水６５４３９９） 摘要：病毒是马铃薯生产过程中危害较大的一类病原，为快速检测出云南省马铃薯主要病毒种类，依据病毒 外壳蛋白基因序列设计合成了马铃薯Ｙ病毒（ＰＶＹ）、马铃薯Ｓ病毒（ＰＶＳ）、马铃薯卷叶病毒（ＰＬＲＶ）的特 异性引物，从退火温度、最低检测浓度、热反应循环条件、病毒间的模板及引物问的最佳组合浓度进行优化， 建立了三重ＲＴ—ＰＣＲ反应体系。结果表明：该优化体系可同步扩增出上述３种病毒，分别得到４８０ ｂｐ（ＰＶＹ）、 １８７ ｂｐ（ＰＶＳ）、３３６ ｂｐ（ＰＬＲＶ）大小的扩增片段。优化的三重ＲＴ—ＰＣＲ反应体系可快速、灵敏、简便的检测 到单一或复合侵染的马铃薯病毒，有利于马铃薯病毒病的早期检测和防治，将为云南省马铃薯种苗脱毒、继 代、田间植株的高产栽培等有重要实践作用。 关键词：马铃薯；病毒；多重ＲＴ—ＰＣＲ检测 中图分类号：Ｓ ４３５．３２ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００４—３９０Ｘ（２０１５）０４—０５３５—０６ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＰＶＹ．ＰＶＳ ａｎｄ ＰＬＲＶ ｂｙ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＲＴ—ＰＣＲ ＨＵＡＮＧ Ｄａｎ ，ＹＵ Ｋｕｎ ，ＣＨＥＮ Ｊｉａｎｂｉｎ ，ＣＡＩ Ｈｏｎｇ ，ＺＨＵ Ｙｏｕｙｏｎｇ （１．Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｙｕｎｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｙｕｎｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０２０１，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｏｆ Ｙｕｎｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｊｉａｎｓｈｕｉ Ｃｏｕｎｔｙ，Ｊｉａｎｓｈｕｉ ６５４３９９，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｖｉｒｕｓ ｉｓ ｔｈｅ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｈａｒｍｆｕｌ ｔｏ ｔｈｅ ｐｏｔａｔｏｅｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｐｏｔａｔｏｅｓ ｖｉｒｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ Ｙｕｎｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，ｔｈｅ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｙ （Ｐ、，Ｙ），ｐｏｔａｔｏ ｖｉｕｓ Ｓ（ＰＶＳ），ａｎｄ ｐｏｔｒａｔｏ ｌｅａｆ ｒｏｌｌ ｖｉｒｕｓ（ＰＩＢＶ）ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅｉｒ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｔｉｐｌｅ ＲＴ－ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｗａｓ ｅｓｔａｂ— ｒｌｉｓｈｅｄ ｆｒｏｍ ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｍｉｎｉｍｕｍ ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｅｓｔ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒｕｓ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｗｉｔｈ ｐｒｉｍｅｒｓ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｉｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＲＴ－ＰＣＲ ｃｏｕｌｄ ａｍｐｌｉｆｙ ｔｈｒｅｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ，ａｎｄ ｔｈｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ４８０ ｂｐ（ＰＶＹ），１８７ ｂｐ（ＰＶＳ） ａｎｄ ３３６ ｂｐ（ＰＬＲＶ），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｉｓ ｏｐｔｉｉｚｅｄ ｍｕｌｍｔｉｐｌｅｘ ＲＴ－ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｗａｓ ｐｒｏｖｅｄ ｔｏ ｂｅ ｒａｐ— ｉｄ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｉｍｐｌｅ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｓｉｎｇｌｅ ｏｒ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｂｏｖｅ ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｔｏ ｅａｒｌｙ ｄｅｔｅｃ— ｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｏｔａｔｏ ｖｉｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｔｈｉｓ ｒｅｓｕｌｔ ｗｉｌｌｒ ｈａｖｅ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｐｏｔａｔｏ ｓｅｅｄ－ ｌｉｎｇｓ ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｔｒａｎｓ—ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｙｉｅｌｄ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｅｌｄ ｉｎ Ｙｕｎｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｐｏｔａｔｏ；ｖｉｒｕｓ；ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＲＴ－ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ 收稿日期：２０１４—０８—２０ 修回日期：２０１４—０９—１６ 网络出版时间：２０１５—０７—１６ １７：３１ 基金项目：云南省农业产业化专项项目（云财农［２０１３］３６４号）。 作者简介：黄丹（１９８７一），女，四川Ｉ内江人，在读研究生，主要从事植物病毒病害研究。 Ｅ－ｍａｉｌ：１０４５７６０２４０＠ｑｑ．ＣＯＢ 通信作者Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：蔡红（１９７２一），女，云南宣威人，博士，教授，主要从事植物病毒及类似病害研 究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｃａｉｈｏｎｇＯ６２３＠１２６．ｃｏｍ 网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／５３．１０４４．Ｓ．２０１５０７１６．１７３１．００８．ｈｔｍｌ ５３６ 云南农业大学学报 第３Ｏ卷 马铃薯病毒病是马铃薯非常重要的一类病 害，病毒的侵染可引起马铃薯种质退化，导致 产量急剧下降 』。我国各马铃薯主产区均有马 铃薯病毒病发生 Ｊ。主要的马铃薯病毒种类有 马铃薯ｘ病毒（Ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｘ，ＰＶＸ）、马铃薯 卷叶病毒（Ｐｏｔａｔｏ ｌｅａｆ ｒｏｌｌ ｖｉｒｕｓ，ＰＬＲＶ）、马铃薯 Ｙ病毒（Ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｙ，ＰＶＹ）、马铃薯Ａ病毒 （Ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ａ，ＰＶＡ）和马铃薯Ｓ病毒（Ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｓ，ＰＶＳ） －４］。其中ＰＶＹ和ＰＬＲＶ病毒对 马铃薯生产的影响最大，其次是ＰＶＸ和ＰＶＡ， ＰＶＳ影响较小 』。由于低纬度高海拔组合形成 的地理气候影响，云南马铃薯病毒病的发生较 严重。通过检测云南省各地的马铃薯种薯种苗 样品，发现在云南省主要存在ＰＶＸ，ＰＶＳ，ＰＶＹ 及ＰＬＲＶ，且这几种病毒往往复合侵染。在国内 外已有单重ＲＴ．ＰＣＲ检测ＰＶＹ，ＰＶＳ，ＰＬＲＶ， ＰＶＸ等应用 。 ，但单重ＲＴ—ＰＣＲ费时费力， 不能满足快速检测田间大批量脱毒种薯种苗的 需求，且用于马铃薯病毒检测的血清制剂费用 较高¨卜 ，因此，迫切需要经济且方便的多重 ＲＴ—ＰＣＲ检测方法。在ＲＴ—ＰＣＲ中使用一对以上 的引物就称之为多重ＲＴ．ＰＣＲ，它能够同时扩增 出目的ＤＮＡ中的几个片段，既省时省力又可降 低成本¨ 。本研究针对云南省主要的马铃薯病 毒种类，设计了ＰＶＹ，ＰＶＳ，ＰＬＲＶ这３种病毒 的特异性引物，从退火温度、最低检测浓度、 热反应循环条件、病毒间的模板及引物间的最 佳组合浓度４个方面优化反应条件。并利用优 化的三重ＲＴ．ＰＣＲ反应体系，对云南省马铃薯产 区的部分样品进行检测。 １材料与方法 １．１试验材料 从云南农业大学云南省马铃薯病害研究室及 云南省玉龙、剑川、会泽、寻甸、鹤庆等县采集 的组培苗或叶片共２０个样品（表１）。 １．２病毒ＲＮＡ的提取和ｃＤＮＡ的合成 采用北京ＴＩＡＮＧＥＮ生化科技有限公司的 ＲＮＡｐｒｅｐ Ｐｌａｎｔ Ｋｉｔ试剂盒提取带毒马铃薯植株的 总ＲＮＡ，并对病毒ＲＮＡ质量进行检测，作为待 测的病毒ＲＮＡ；采用ＴａＫａＲａ公司的ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩ １ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ试剂盒完成第一链 的合成，引物序列为试剂盒自带的Ｏｌｉｇｏ Ｐｒｉｍｅｒ。 表１用于本研究的供试样品 Ｔａｂ．１ Ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ １．３ ＰＣＲ反应 根据ＰＶＹ，ＰＶＳ以及ＰＬＲＶ的基因组编码外 壳蛋白（ＣＰ）的ＲＮＡ保守序列设计特异性引物 （表２）。 １．３．１单重ＲＴ－ＰＣＲ反应 单重ＲＴ—ＰＣＲ反应体系（总体系２５ Ｌ）为： ２×Ｐｏｗｅｒ Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＢｉｏＴｅｋｅ）１２．５ ＩｘＬ， １０￣ｍｏｌ／Ｌ的上游、下游引物各１ Ｌ，１ Ｌ ｃＤＮＡ （质量浓度大于１００ ｎｇ／ Ｌ）作为模板，双蒸水补 足２５ ＩＪ，Ｌ。ＰＣＲ反应条件：９４℃预变性２ ｍｉｎ， ９４℃变性３０ Ｓ，退火温度从５１℃到６２℃设１２个 温度梯度３０ Ｓ，７２℃延伸１ ｍｉｎ，循环次数设置为 ３０个循环、３５个循环、４Ｏ个循环、４５个循环。 ７２℃延伸１０ ｍｉｎ；取３ ＩｘＬ扩增产物在２％的琼脂 糖凝胶中电泳检测。 第４期 黄丹，等：马铃薯病毒ＰＶＹ，ＰＶＳ和ＰＬＲＶ多重ＲＴ—ＰＣＲ检测 ５３７ １．３．２灵敏度检测 马铃薯病毒单重ＲＴ．ＰＣＲ反应灵敏度检测在 体系其他组份种类和含量不变的情况下，先将３ 种马铃薯病毒的ＲＮＡ进行单重反转录，反应得到 的３种病毒的ｃＤＮＡ运用核酸蛋白分析仪（Ｕｌｔｒｏ－ ｓｐｅｅ ２ １００ ｐｒｏ）、采用分光光度法测定其含量，然 后通过加ｅＤＮＡ或ｄｄＨ ０进行调节，把每种病毒 的ｅＤＮＡ质量浓度调整为４００，３００，２００，１００， ５０，２５ ｎｓ／ 共６个梯度，再进行单重ＰＣＲ反 应，得到这３种病毒的最低检测质量浓度。 １．３．３多重ＲＴ—ＰＣＲ反应 三重ＲＴ—ＰＣＲ的组合采用ＰＶＳ，ＰＶＹ和ＰＬ－ ＲＶ。由于引物与模板间的竞争对多重ＲＴ—ＰＣＲ反 应体系的影响非常明显，且不同引物间的竞争性 大小也是不同的，所以本试验的引物与模板间的 优化采用以下质量浓度组合方式：取１００ ｎｓ／ 的３种病毒合成的ｅＤＮＡ作为反应的模板，模板 设置为１，１．３，１．５ 等３种情况，分别与以下 几种引物量进行组合（表３）。 表３用于三重ＲＴ－ＰＣＲ反应的 ３种马铃薯病毒引物组合方式 Ｔａｂ．３ Ｐｒｉｍｅｒ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｆｏｒｔｒｉｐｌｅ ＲＴ—ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｆ ３ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ 引物用量／ＩｘＬ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ 序号 Ｎｏ． ＰｖＹ引物 ＰＶＳ引物 ＰＬＲＶ引物 ＰＶＹ ｐｒｉｍｅｒ ＰＶＳ ｐｒｉｍｅｒ ＰＬＲＶ ｐｒｉｍｅｒ 优化后的最佳的三重ＲＴ－ＰＣＲ反应体系（总 体系２５ ）为：取１００ ａｓ／ 的３种病毒合成的 ｃＤＮＡ各１．３ 作为反应模板，对单个样品采用 ３００ ｎｓ／ｔｘＬ的ｃＤＮＡ ３．９ Ｌ作为反应模板，２× Ｐｏｗｅｒ Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＢｉｏＴｅｋｅ）１２．５ Ｌ， １０￣ｍｏｌ／Ｌ的３种病毒的上、下游引物各为ＰＶＳ为 ０．８ Ｌ，ＰＶＹ为１ Ｌ，ＰＬＲＶ为１．２ Ｌ，双蒸水 补足２５ Ｌ。ＰＣＲ反应条件：９４ 预变性２ ｍｉｎ， ９４℃变性３０ Ｓ，５８ ｏＣ退火３０ Ｓ，７２ ｏＣ延伸１ ｍｉｎ， 设置３５个循环，最后７２℃延伸１０ ｍｉｎ；ＰＣＲ反 应结束后，取出扩增产物３ 进行琼脂糖凝胶电 泳检测。 ２结果与分析 ２．１ ＲＮＡ质量 采用１％琼脂糖凝胶电泳鉴定总ＲＮＡ抽提样 品的完整性。所提取的总ＲＮＡ经分光光度计检 测，总ＲＮＡ ＯＤ：６０／ＯＤ２８０在１．８—２．０，说明提取 ＲＮＡ的纯度较高。 ２．２ ＰＣＲ检测结果 ２．２．１单重ＰＣＲ检测结果 以提取的ＲＮＡ反转录产物作为模板进行单重 ＰＣＲ反应。经２％的琼脂糖凝胶电泳检测ＰＣＲ产 物。由图１及基因序列比对结果可看出，所设计 的ＰＶＹ，ＰＶＳ和ＰＬＲＶ的引物具有很好的特异性 和可重复性，在退火温度为５８℃，循环次数为 ３５个循环进行单重ＰＣＲ后得到各病毒基因的ＰＣＲ 扩增产物条带均清晰，明亮，无杂带。其扩增产 物经测序后进行序列比对，同源性均在９８％以 上。因此，该反应条件可用于马铃薯病毒病进行 单重ＲＴ．ＰＣＲ检测和进行后续多重ＲＴ—ＰＣＲ体系 的建立、优化。 云南农业大学学报 第３０卷 ［Ｍ］．北京：中国三峡出版社，２００６：１２—３２． ［２］高艳玲，张威，白艳菊，等．马铃薯主产区病毒病发生隋 况调查分析［Ｊ］．植物保护，２０１１，３７（３）：１４９—１５１． ［３］杜志游．马铃薯病毒和类病毒的分子诊断方法研究 ［Ｄ］．杭州：浙江大学，２００６． ［４］钟婷婷．马铃薯病毒病ＲＴ—ＰＣＲ检测体系的建立及病 毒病在四川省的种类与分布［Ｄ］．雅安：四川农业 大学，２００７． ［５］袁青，殷幼平，王中康，等．二重ＲＴ—ＰＣＲ快速检测 马铃薯病毒的方法［Ｊ］．植物检疫，２００５，１９（３）： １３５—１３８． ［６］袁青．马铃薯病毒病多重ＲＴ－ＰＣＲ检测技术研究 ［Ｄ］．重庆：西南大学，２００４． ［７］袁东征，王帆．马铃薯无公害栽培的几项改进措施 ［Ｊ］．西北园艺，２００７（３）：４５． ［８］李谋智．马铃薯产业必须重视种薯生产［Ｊ］．甘肃农 业，２００３（１０）：４８—４９． ［９］黄元勋，田发端，赵迎春，等．论马铃薯营养成分及 其品质改良［Ｊ］．恩施职业技术学院学报：综合版， ２００２，１４（３）：７７—８３． ［１ｏ］何建国，刘浩，徐迎菊，等．论宁夏马铃薯产业发 展的技术对策［Ｊ］．甘肃科技，２０１１，２７（３）：１—５． ［１１］代廷非．多重ＲＴ—ＰＣＲ技术检测马铃薯病毒的研究 ［Ｄ］．雅安：四川农业大学，２０１１． ［１２］路平．马铃薯三种主要病毒的ＥＬＩＳＡ和ＲＴ—ＰＣＲ检 测技术的研究［Ｄ］．兰州：甘肃农业大学．２００５． ［１３］董代幸，张祥林，罗明，等．马铃薯病毒一步法多重 ＲＴ－ＰＣＲ检测技术的构建［Ｊ］．微生物学通报， ２０１１，３８（１）：１３１—１３７． ［１４］ＪＥＬＫＭＡＮＮ Ｗ，ＫＥＩＭ．ＫＯＮＲＡＤ Ｒ．Ａｎ ｉｍｍｕｎｏ．ｃａｐ． ｔｕｒｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｌａｔｅ—ｔｒａｐｐｅｄ ＥＬＩＳＡ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｐｌｅ ｓｔｅｍ ｐｉｔｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏ－ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９９７，１４５（１１／１２）：４９９—５０４． ［１５］ＨＡＤＩＤＩ Ａ，ＭＯＮＴＡＳＳＥＲ Ｍ Ｓ，ＬＥＶＹ Ｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｔａｔｏ ｌｅａｆ－ｒｏｌｌ ａｎｄ ｓｔｒａｗ ｂｅｒｒｙ ｍｉｌｄ ｙｅｌｌｏｗ－－ｅｄｇｅ ｌｕｔｅｏｕｓ－・ ｖｉｒｕｓ ｂｙ ＲＴ－ＰＣＲ［Ｊ］．Ｐｌｎａｔ Ｄｉｓｅａｓｅ，１９９３，７７（６）： ５９５—６０１． ［１６］李浩戈，吴元华，赵秀香．马铃薯Ｙ病毒的ＲＴ－ＰＣＲ检 测［Ｊ］．沈阳农业大学学报，１９９０，３０（３）：２４４—２４６． ［１７］Ａ￣ＮＤＯＴＡＮ Ｂ ０，ＳＨＩＥＬ Ｐ Ｊ，ＢＥＲＧＥＲ Ｐ Ｈ．Ｓｉｍｕｌ－ ｔｎａｅｏｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓｅｓ，ＰＬＲＶ，ＰＶＡ，ＰＶＸ ｎａｄ ＰＶＹ ｆｒｏｍ ｄｏｒｍａｎｔ ｐｏｔａｔｏ ｔｕｂｅｒｓ ｂｙ ＴａｑＭａｎ ｒｅａｌ－ ｔｉｍｅ ＲＴ・ＰＣＲ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２００７，１４２（２）：１—９． ［１８］ＨＩＤＡＹＥＴ Ｂ，ＣＯＳＫＵＮ Ｇ，ＯＺＤＥＭＩＲ Ｅ Ｏ Ｌ，ｅｔ ａ１．． Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ａｐｈｉｄｓ Ｏｆｆ ｔｈｅ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ（ＰＶＹ，ＰＶＳ ａｎｄ ＰＬＲＶ）ｉｎ ｔｈｅ ｈｉｇｈ ａｌｔｉｔｕｄｅ ａｒｅａｓ ｏｆ Ｔｕｒｋｅｙ［Ｊ］．Ｐａｋｉｓｔｎａ Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉ－ ｅｎｃｅｓ，２００６，９（４）：７５９—７６５．
