维普资讯 http://www.cqvip.com 广东农业科学２００８年第２期 ３１ 发光杆菌１ ０２９发酵培养基成分优化组合研究 孙东磊 ，林志雄 ，匡石滋 ，万树青 ，张自煌 ，田世尧 （１．广东省农科院果树研究所，广东广州５１０６４０；２．华南农业大学资源环境学院，广东广州５１０６４２； ３．惠州市绿茵环境工程有限公司．广东惠州５１６００１） 摘要：采用ＳＡＳ软件中的Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ设计对影响发光杆菌１０２９发酵液抑菌效果的重要因素进行了筛选。选出 ＭｇＣ１ 和（ＮＨ４）￣Ｏ 为影响实验的两个重要因素，并通过响应面分析法对发光杆菌１０２９号菌株的发酵培养基成分进行优 化，采用优化培养基得到的发酵液对烟草青枯病菌的抑菌圈直径提高了Ｏ．５８ ｍｍ。 关键词：发光杆菌；响应面；发酵；优化 中图分类号：Ｑ９３９．１ 文献标识码：Ａ 文章编号：ｌＯＯ４—８７４Ｘ（２００８）０２—００３１—０４ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ １０２９ ＳＵＮ Ｄｏｎｇ－ｌｅｉ ，ＬＩＮ Ｚｈｉ－ｘｉｏｎｇ ，ＫＵＡＮＧ Ｓｈｉ－ｚｉ ，ＷＡＮ Ｓｈｕ－ｑｉｎｇ２，ＺＨＡＮＧ Ｚｉ－ｈｕａｎｇ ，ＴＩＡＮ Ｓｈｉ－ｙａｏ （１．Ｐｏｍｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆＣｕａｎｇｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙ ｆＡｇｒｏｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６４０，Ｃｈｉｎａ，＂２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｅｓｏｕ￣ｅ ａｎｄ Ｅｎｖｉｏｕｍｅｎｔ Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａ！Ｕｎ＆ｅ￣ｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５ １０６４２，Ｃｈｉｎａ；３．Ｈｕｉｚｈｏｕ Ｇｒｅｅｎｎｅｓｓ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｐｒｑｅｃｔ Ｌｔｄ．，Ｈｕｉｚｈｏｕ ５１６００１，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔｓ：Ｂｙ ｕｓｉｎｇ Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ＳＡＳ，ＭｇＣ１２ ａｎｄ（ＮＨ４）２Ｓ０４ ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ ｔｏ ｂｅ ｔｗｏ ｍａｊｏｒ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ，ａｎｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ １０２９ ｗａｓ ｏｐｔｉｍｉ ｚｅｄ ｂｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ（ＲＳＡ）．Ｗｉｔｈ ｏｐｔｉｍａｌ ｍｅｄｉｕｍ， ｔｈｅ ｄｉａｍｅｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｉｒｃｌｅ ｗｈｉｃｈ ｔｏ Ｒａ！ｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ ｗｉｌｌ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ｏ．５８ｍｍ ｃｏｍｐａｒｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｂｅｆｏｒｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ；ＲＳＡ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；ｏｐｔｉｍｉｚｅ 发光杆菌（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）是肠杆菌科 （Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）发光杆菌属（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）的一种 线虫共生细菌，革兰氏染色为阴性，兼性厌氧。发光杆 供试材料为发光杆菌１０２９菌株．从异小杆线虫体 内直接分离得到。培养基为平板毒力测定双层培养基 和葡萄糖琼脂（ＰＤＡ）基础培养基，其中平板毒力测定 双层培养基底层为１０ ｍＬ琼脂、上层为１０ ｍＬ营养琼 菌存在于昆虫病原线虫肠道内。可随线虫的侵染进入 寄主昆虫血腔，迅速繁殖并产生多种代谢产物．抑制 其他杂菌的污染，从而保护线虫繁殖的环境［１１。杨裕兵 等［２１研究发光杆菌１０２９代谢产物对多种植物病原菌的 抑制作用，结果表明发光杆菌１０２９发酵液具有广谱抑 菌活性。本研究以烟草青枯病病菌为指示菌，利用ＳＡＳ 软件中的Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ设计和响应面分析法对该 菌株的摇瓶发酵培养基成分进行了优化组合，现将研 究结果报道如下。 脂（ＮＡ）或者马铃薯；每升葡萄糖琼脂基础培养基含蛋 白胨１５ ｇ、蔗糖１０ ｇ、氯化钠５ ｇ、磷酸二氢钾０。５ ｇ【３１。 １。２试验方法 １．２．１菌体悬浮液制备用微量移液器吸取适量（以覆 盖斜面为准）无菌水加到培养２４ ｈ的菌种斜面试管 中，将菌体洗落并混匀，将指示菌烟草青枯病菌的浓度 控制在８×１０ ＣＦＵ／ｍＬ。 １。２．２摇瓶发酵培养将２０ ｍＬ供试液体培养基装入 １材料与方法 １．１试验材料 收稿日期：２００７－０９—２８ １００ ｍＬ三角瓶中，在１２１ｏＣ高温下灭菌１５ ｍｉｎ，然后接 入０。５ ｍＬ菌悬液，在２８ｏＣ、１７０ ｒ／ｍｉｎ的摇床上振荡培 养７２ ｈ。 作者简介：孙东磊（１９７８一），男，在读硕士生 通讯作者：田世尧（１９５７一），男，研究员，Ｅ—ｍａｉｈｔｉａｎｓｈｉｙａｏ＠ １２６．ｃｏｎ １。２。３抑菌效果测定方法测定参照慕立义 的抑菌圈 法。 １。２．４发酵培养基主要成分优化观察了蔗糖（ＣＫ）、 维普资讯 http://www.cqvip.com ３２ 麸皮、化合物Ａ、可溶性淀粉、玉米粉等不同碳源以及 蛋白胨、豆渣、玉米粉、化合物Ｂ、大豆蛋白粉、酵母粉、 尿素、氯化铵等不同氮源对发光杆菌１０２９菌株生产抑 菌物质量的影响：将基础培养基中的相应成分去掉，添 加相同质量浓度的各种碳源、氮源。通过测定发酵液对 烟草青枯病菌的抑制效果（抑菌圈直径的大小），确定 最佳碳源、氮源及其最适抑菌浓度。 １－２．５响应面法优化培养基根据１．２．４确定的最佳碳 源、氮源．采用ＳＡＳ软件中的Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ设计对 ８ １ ２ ｌ４ ｌ ６ ｌ８ ２０ ２２ 化合物Ａ浓度（ｇ，ｌ ） 影响发光杆菌１０２９液体发酵产生抑菌物质量的重要 因素进行筛选，每个试验组重复３次。通过响应面分析 法得Ｎ－－次回归方程式，用此方程推测出响应变量的 最大值以及获得此最大值时自变量的取值［５１优化发酵 培养基配方。 ２结果与分析 ２．１发酵培养基主要成分的筛选 ２．１．１发酵最佳碳源８ ７ ６ ５ ４ ３ ２一岂宣一 臣枢荤 碳水化合物是供应微生物碳元 ●０ 素的主要营养物质，是构成菌体细胞的重要材料，也是 抗生素发酵的主要原料之一［６１。不同碳源对发光杆菌 １０２９发酵液抑菌效果影响的试验结果如表１所示。从 表１可以看出，当麸皮、化合物Ａ、可溶性淀粉作为碳 源时，其发酵液的抑菌效果均优于蔗糖。其中化合物Ａ 作为碳源时得到的发酵液抑菌效果最好，抑菌圈直径 达到６．９８ ｍｍ。 表１不同碳源对发光杆菌１０２９发酵液抑菌效果的影响 抑菌圈直径 碳源 （ｍｍ） 蔗糖（Ｃ ６．７４＿－ｆ）．０３ａｂ 麸皮 ６．８ １±０．０９ａ 化合物Ａ ６．９８±Ｑ０８ａ 可溶性淀粉 ６Ｉ２３ １２ｂｅ 玉米粉 ５．７２±ｎｌ１ｃ 注：表中同列数据后英文字母不同者表示经ＤＭＲＴ法测验 差异显著（Ｐ＞０．０５），表２同。 ２．１．２碳源浓度菌体所需的营养物质之间应有适当 的比例，当选择培养基中碳源所占的比例最合适时，其 产素能力可达到最大值。图１为不同化合物Ａ浓度对 发光杆菌１０２９发酵液抑菌效果的影响结果。由图１可 知，当化合物Ａ浓度为１６ ｇ／Ｌ时发酵液抑菌效果达到 最强，之后随着化合物Ａ浓度的升高，抑菌效果减弱。 可见，菌体生长和抑菌物质的生产都有其碳源浓度范 围，如果超过这个范围．反而会抑制菌体的生长和抑菌 物质的产生。 图１不同化合物Ａ浓度对发酵液抑茵效果的影响 表２不同氮源对发光杆菌１０２９发酵液抑菌效果的影响 抑菌圈直径 氮源 ｆｍｍ１ 蛋白胨 ６．７４：由１０３ １ａ 豆渣 ４６４ｊｎ４３ｂ 玉米粉 ２４９ｉ０．０５ｃ 化合物Ｂ ６．８３±ｎｌ１ａ 大豆蛋白粉 ３．２ １±ｏ．２０ｃ 酵母粉 ４．９１±ｎ３２ｂ 尿素 ｎ６５±ｎ０９ｄ 氯化铵 ０．４６＿－－ｆ）１０５ｄ ２．１．３最佳氮源 氮源主要用来构成菌体细胞中的蛋 白质、核酸、酶以及各种初级和次级代谢产物的含氮有 机物［５１。不同氮源对发光杆菌１０２９发酵液抑菌效果的 影响见表２。从表２可以看出，以化合物Ｂ为氮源时， 发光杆菌１０２９发酵液的抑菌效果最好，抑菌圈达到 ６．８３ ｍｍ。 ２．１．４氮源浓度在发光杆菌发酵培养过程中．除了碳 源，还要选择培养基中氮源所占的最合适比例，使之能 被菌体更好地利用并产生更多的抑菌物质。不同化合 物Ｂ浓度对发光杆菌１０２９发酵液抑菌效果的影响结 果见图２。由图２可知，当化合物Ｂ浓度为２４ Ｌ时， 发酵液的抑菌效果达到最强．之后随着化合物Ｂ浓度 的升高，抑菌效果减弱。这说明发光杆菌１０２９产素有 其氮源浓度范围，如果超过这个范围．将抑制菌体的生 长和抑菌物质的积累 ８ —１ 兰６ ４ ３ 互・ 垩１ ０ ｌ０ ｌ２ ｌ４ ｌ８ ２４ ２６ ３０ 化合物Ｂ浓俊（ｇ／Ｌ） 图２ 不同化合物Ｂ浓度对发酵液抑菌效果的影响 维普资讯 http://www.cqvip.com ２．２培养基的优化 ２＿２＿１ Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ设计试验试验选择Ｆａｃｔｏｒｓ （因子）＝ｌＯ、Ｒｕｎｓ（实验次数）＝１２的Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ法 进行设计，对培养基组成成分的７个因素进行察．另设 ３个因素作为虚构变量用以估计试验误差。每个因素 取低水平“一１”和高水平“１”２个水平。方差分析比较各 因素的ｔ值和可信度，选择可信度大于８５％的因素作 为重要因素［７１。试验回归分析结果见表３。由表３可知， ｆＮＨ４）２ＳＯ 和ＭｇＣ１ 的可信度均高于８５％。对发酵液的 抑菌效果影响显著，而化合物Ａ、化合物Ｂ、ＫＮＯ，、 ＮａＣ１、ＫＨ：ＰＯ 的可信度皆低于８５％，对发酵液的抑菌 效果影响不显著。由此确定（ＮＨ４）２ＳＯ 和ＭｇＣ１：可作为 重要影响因素进一步进行优化实验。 表３ Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ试验回归分析结果 ２＿２＿２响应面优化试验根据Ｂｏｘ—Ｗｉｌｓｏｎ的中心组合 设计原理，以（ＮＨ４）：ＳＯ 和ＭｇＣ１ 两个因素为自变量、指 示菌抑菌圈直径（去除内径值）为响应值设计了二因素 五水平共１３个试验点的响应面分析试验１７１。发酵培养 基中其他组成为化合物Ａ １６ ｇ／Ｌ、化合物Ｂ ２４ ｇ／Ｌ、 ＮａＣ１ ６ ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．６ ｇ／Ｌ。试验设计和分析结果见表 ４和表５。方差分析结果表明，该模型失拟不显著、回归 表４响应分析法实验设计及结果 ３３ 表５回归方程各项的方差分析表 显著，确定系数Ｒ：＝Ｏ．９００９，说明该模型与实际试验拟 合很好。可以用于发光杆菌１０２９菌株发酵生产的理论 预测。由试验数据拟合的二次回归方程式为：Ｙ＝ ７．２３５０００—０．０９７７５２Ｘ１—０．３８Ｏ８４６ ２—０．１ ６３７５０Ｘ１ 一 ０．２２００００ＸｚＸ 一０．３７８７５１Ｘ２２。利用ＳＡＳ软件由响应面回 归分析和回归方程拟和可以绘出响应面分析图３和等 高线图４。由图３和图４经响应面的规范形分析表明 回归模型存在稳定点，稳定点是极大值．其预测值为 ７，３２ ｍｍ．规范形分析结果列于表６ 可得到培养基的 最佳配方为：化合物Ａ ｌ６ｇ／Ｌ、化合物Ｂ ２４ ｇ／Ｌ、ＮａＣ１ ６ 、 图３ Ｙ＝ｆ（Ｘ“ 的响应面分析图 １ ０．５ ０ —０．５ ｌ 一ｌ 一（）．５ （） （）．５ ｌ ＸＩ 图４ ｙ＝ｆ（ｘ“置 的等高图 维普资讯 http://www.cqvip.com ｇｅＬ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．６ ｇ／Ｌ、ＭｇＣ１２ ０．９８ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２Ｓ０４ ３．６８ ｇｅＬ， Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ设计法和响应面分析法是近 此时根据拟合的二次回归方程式：Ｙ＝７．２３５０００— 年来用于微生物发酵条件优化的有效方法［７１。Ｐｌａｃｋｅｔｔ— ０．０９７７５２Ｘｌ一０．３８０８４６Ｘ２—０．１６３７５０Ｘｌ —０．２２Ｏ０ｏ０ ｌ一 Ｂｕｒｍａｎ设计法是一种以不完全平衡块为原理的部分 ０．３７８７５１Ｘ２２得到预测的最大响应值为７．３２ ｍｍ，为证 析因实验设计法，试图用最少实验次数使因素的主效 实预测结果的正确性，在稳定点（ ， ）为（０．９８，３．６８） 应得到尽可能的精确估计，能够从众多考察因素中快 处进行重复摇瓶实验，重复３次，得出平均响应值为 速、有效地筛选出最为重要的几个因素，以供进一步研 ７．２８。预测值与实验值之间的良好拟合性证实了模型 究。响应面分析法，用于研究多因子系统中因子交互作 的有效性及存在着极大值点。分析结果表明，发光杆菌 用及达到最大响应值时所对应的最佳条件［６１。虽然它与 ｌ０２９在优化的培养基中得到的发酵液的抑菌圈直径 传统的“正交实验法”都建立在正交设计原理的基础 为７．３２ ｍｍ，较基础发酵培养基得到的发酵液的抑菌 上，但较后者更为有效，其中较常用的是Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ 圈直径６．７４ ｍｍ增加了０．５８ ｍｍ。 法和Ｂｏｘ—Ｗｉｌｓｏｎ法。 参考文献： 表６响应面的规范形分析结果 【１】丛斌，刘维志，杨怀文．昆虫病原线虫研究和利用的历史现状 与展望ｆＪ１．沈阳农业大学学报，１９９９，３０：３４３—３５３． 【２】杨裕兵．发光杆菌诱变方法和发酵液抑菌活性的研究【Ｄ】．武 汉：华中农业大学．２００７． 【３】杨秀芬，邱德文，焦宁宁，等．致病杆菌Ｄ４３菌株产素培养基 及发酵条件［Ｊ】．中国生物防治，２００６，２２：５８—６２． ３结语 【４】慕立义．植物化学保护研究方法【Ｍ】．北京：中国农业出版社， 利用微生物生产有用代谢产物是一个复杂的发酵 １９９４：７６—８１． 过程，既涉及生物细胞的生长、生理和繁殖等生命活动 【５】Ｐｏｉｎａｒ Ｇ Ｏ，Ｔｈｏｍａｓ Ｊ，Ｈａｙｇｏｏｄ Ｇ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｉｎｓｅｃｔ ｐａｒａｓｉｔｉｃ ｒｈａｂｄ—ｉｔｏｉｄ，Ｈｅｔｅｒｏｒｂａｂｄｉｔｉｓ 的反应过程，又涉及生物细胞分泌的各种酶所催化的 ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈｏｒａｇｅｎ ｎ．ｓｐ［Ｊ］．Ｓｏｉｌ Ｂｉｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９８０，１２：５－９． 生化反应过程。微生物发酵的生产水平不仅取决于生 【６】李艳．发酵Ｔ业概论【Ｍ】．北京：中国轻Ｔ业 版社，１９９９＂２１９— 产菌种本身的性能，还取决于发酵过程中是否具有合 ２３８． 适的环境条件。只有在最适条件下，菌种的生产能力才 【７】褚以文．微生物培养基优化方法及其ＯＰＴＩ优化软件ｆＪ］．国外 能得到充分表达。 医药抗生素分册，１９９９．２０：５８—６０。６６． ｊ －ｊ；ｔ 夸 ・夸 ｊｋ・ ；｝ ｊｋ・ｊｋ・ｊ；ｔ ｊｋ・ｊ －ｊ ｊ 曹ｋ・ｊｋ・ｊｋ・ ；｝ｊ ｊｋ・ｊｋ・ｊｋ・ｊ ｊ －夸 ・ｊｋ・ｊｋ・ｊｋ・ｊｋ・ ｜ｔｒ ｊｋ・夸 ・ｊ －ｊ ｊ；ｔ 夸 ・ｊｋ・ｊｋ・ｊ ｊ；ｔ ｊｋ・夸 ・夸 ・夸 ・夸 ・ 我国仔猪营养研究处于国际前沿 随着一系列高效营养、无抗生素及激素残留的饲料研制成 在科技部、中科院和省科技厅的共同支持下．中科院亚热带 功．长期困扰养殖业的“仔猪难养”将成为历史。中科院亚热带 农业生态研究所和湖南正虹科技发展股份有限公司、南昌大学 农业生态研究所印遇龙研究员带领课题组历经４年攻关．将断 开展产学研紧密合作．对“功能性氨基酸和植物提取物对仔猪的 奶仔猪营养生理研究从机体水平提高到分子水平，从定性化提 营养生理功能及其应用研究”进行了艰苦攻关，取得了重要进展。 升到定量化，其开发的断奶仔猪配合饲料在省内外多个养猪场 项目组从分子水平上揭示了功能性氨基酸促进仔猪生长的机 推广应用．不仅让仔猪健康度过断奶应激期，而且减少了饲养 制．从组织和分子层面上揭示了饲喂低蛋白饲料补充氨基酸条 成本，临床抗生素用量也明显下降。在１月１６日举行的成果鉴 件下仔猪的蛋白质周转规律；突破性地发现了甘草次酸与糖皮 定会上．刘筠院士等专家高度评价该成果整体居同类研究的国 质醇激素在结构上的相似性．并研制了具有抗生素和激素功能 际先进水平，部分达国际领先水平。 的药用植物营养剂。根据这些成果开发的断奶仔猪配合饲 猪肉是我国居民的主要肉食品种。养猪业中最难养的是仔 料在湖南、广东、福建、上海等省市的多家猪场推广应用．断奶仔 猪。因为仔猪断奶会引起一系列的应激反应，据调查．我国断奶 猪的腹泻率下降了９成，成活率由９０％提高到９７％，平均日增重 仔猪腹泻率高达５０％～６０％，死亡率为１５％一２０％，严重阻碍了养 提高５％～８％。而每吨饲料降低成本１５～２０元。同时．由于应激反 猪业的健康发展。同时，人们普遍在饲料中添加抗生素来防治 应不明显，仔猪肠道疾病和呼吸道疾病明显减少．临床抗生素的 仔猪腹泻．长期使用造成动物免疫力下降和食品安全问题．严 用量明显下降。目前．这种绿色高效营养的仔猪饲料已推广３８ 重威胁着人类健康。 万ｔ，新增产值１６亿元，经济、社会和生态效益显著。
