RP_HPLC法同时测定红花中羟基红花黄色素A与红花黄色素A的含量

RP-HPLC法同时测定红花中羟基红花黄色素A与红花黄色素A的含量

姚苗苗,任爱农

1

*1,2

,董仲才

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(1.江苏大学药学院,镇江212013;2.江苏省中医药研究院,南京210028;3.雅安三九药业有限公司,雅安625000)摘要 目的:建立红花中羟基红花黄色素A与红花黄色素A的含量测定方法。方法:采用AkasilC18(416mm@250mm,5Lm)色谱柱,以乙腈(A)-014%磷酸(B)为流动相,梯度洗脱(0~30min,10%A;30~50min,15%A;50~55min,25%A;55~60min,10%A),流速017mL#min-1,检测波长403nm,柱温30e。结果:羟基红花黄色素A、红花黄色素A进样量的线性范围分别为01451~1105Lg(r=019993)和01278~01650Lg(r=019996)(n=5);平均加样回收率(n=6)分别为10016%和10310%。结论:本方法快速、灵敏,重复性好,适用于红花中羟基红花黄色素A与红花黄色素A的含量测定。关键词:RP-HPLC;红花;羟基红花黄色素A;红花黄色素A中图分类号:R917

文献标识码:A

文章编号:0254-1793(2010)02-0263-03

RP-HPLCdeterminationofsafflominAandsafflower

yellowAinCarthamustinctoriusL.

YAOMiao-miao,RENAi-nong

1

1,*2

,DONGZhong-cai

3

(1.PharmacyCollege,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,China;2.JiangsuProvincialInstituteofTraditionalChineseMedicine,

Nanjing210028,China;3.YaanSanjiuPharmaceuticalCorporation,LTD.,Yaan625000,China)

Abstract Objective:ToestablishanRP-HPLCmethodforsimultaneousdeterminationofsafflominAandsa-ffloweryellowAinCarthamustinctorius.Methods:TheanalyticalcolumnwasAkasilC18column(416mm@150mm,5Lm).Themobilephasewascomposedofacetonitrile(A)and014%phosphoricacid(B)withgradientelu-tion(0-30min,10%A;30-50min,15%A;50-55min,25%A;55-60min,10%A)ataflowrateof017mL#min.ThewavelengthofUVdetectorwas403nmandcolumntemperaturewas30e.Results:ThelinearrangesofsafflominAandsaffloweryellowAwere01451-1105Lg(r=019993)and01278-01650Lg(r=019996)(n=5),respectively;Theiraveragerecoveries(n=6)were10016%and10310%,respectively.Conclusion:Thismeth-odissensitive,repeatableandsuitabletodeterminethecontentsofsafflominAandsaffloweryellowAinCarthamustinctorius.

Keywords:RP-HPLC;Carthamustinctorius;safflominA;saffloweryellowA 红花为菊科植物红花(CarthamustinctoriusL.)的干燥管状花。红花黄色素(saffloweryellow,SY)为红花中多种水溶性查尔酮成分的混合物,具有

活血通经、化瘀止痛之功效,对冠心病、血管栓塞性疾病、高血压、糖尿病并发症有疗效,并具有镇痛作用和抗炎作用。其中红花黄色素A类成分被认

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为是主要效应物质。王慧琴等人采用高效液相色谱法同步测定了红花中的4种黄色素的含量,结果显示3个产地红花中的羟基红花黄色素A(sa-f

*

通讯作者 Te:l(025)856397;E-mai:llyyy-0@126.com

[2]

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flominA)、红花黄色素A(saffloweryellowA),占所测黄色素总量的88123%,红花黄色素B(saffloweryellowB)和红花黄色素C(safflominC)占所测总量

的11177%。由于前后者含量差别较大,这样也会导致在同一色谱条件下,含量低的成分难以回归基线,从而导致计算不准确,重复性差。所以,选择羟基红花黄色素A、红花黄色素A作为高效液相色谱的含量测定指标,并对4个不同产地红花中羟基红花黄色素A和红花黄色素A进行同步含量测定。

)2)药物分析杂志ChinJPharmAnal2010,30(2)

1 仪器与试药

Waters高效液相色谱仪(Alliance2695四元泵自动进样系统,2996二极管阵列检测器,Empower色谱工作站);MilliporeMilli-Q超纯水制备仪(美国);METTLER万分之一及十万分之一电子天平(瑞士)。KQ-250E型医用超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。

红花药材购于塔城、(雅安三九药业霍城果子沟GAP基地)、四川简阳、河南温县,经南京中医药大学药学院刘训红教授进行品种和品质鉴定;对照品羟基红花黄色素A(批号111637-200502)购于中国药品生物制品检定所,红花黄色素A自制(含量达98%,各项理化常数及谱学数据与文献报道

[7]

212 溶液的制备

21211 混合对照品溶液 分别精密称取对照品羟基红花黄色素A、红花黄色素A适量,用双蒸水制成羟基红花黄色素A浓度为01751mg#mL、红花黄

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色素A浓度为014mg#mL的单一成分对照品储备液。分别精密量取上述羟基红花黄色素A储备液110mL、红花黄色素A储备液110mL,置于同一10mL量瓶中,用双蒸水定容至刻度,摇匀。即得羟基红

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花黄色素A浓度为010751mg#mL、红花黄色素A浓度为0104mg#mL的混合对照品溶液。21212 供试品溶液 取红花药材粉末(过3号筛)约014g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入双蒸水50mL,称定重量,超声处理(功率300W,频率50kHz)40min,放冷,再称定重量,用双蒸水补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。213 方法学考察

21311 线性关系考察 分别精密吸取/212110项下混合对照品溶液6,8,10,12,14LL,进样测定,记录峰面积,以峰面积Y对进样量X(Lg)进行线性回归,得羟基红花黄色素A、红花黄色素A回归方程分别为:

Y=3150@10X-1176@10 r=019993

Y=4122@10X-5152@10 r=019996

结果表明上述2种成分进样量分别在01451~1105Lg和01278~01650Lg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

21312 精密度试验 精密吸取/212110项下混合对照品溶液10LL,连续进样5次,记录峰面积。结果羟基红花黄色素A、红花黄色素A峰面积的RSD分别为017%和014%。21313 稳定性试验 取供试品溶液,分别于0,2,4,6,8,10,12h进样10LL,记录峰面积。结果羟基红花黄色素A、红花黄色素A峰面积的RSD分别为110%和015%,表明供试品溶液在12h内稳定。21314 重复性试验 精密称取同一红花药材粉末(过3号筛)6份,按/212120项下方法制备供试品溶液,分别进样10LL,记录峰面积,计算含量。结果羟基红花黄色素A、红花黄色素A含量平均值分别为1012mg#g和6122mg#g,RSD分别为

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6

5

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一致);乙腈为色谱纯,甲醇为分析

纯,水为双蒸水。

2 方法与结果

211 色谱条件 色谱柱:AlltimaC18柱(250mm@416mm,5Lm);流动相:乙腈(A)-014%磷酸(B),梯度洗脱(0~30min,10%A;30~50min,15%A;50~55min,25%A;55~60min,10%A);流速:017mL#min,检测波长:403nm;柱温:30e;分离度:两组分均大于115;理论塔板数:按羟基红花黄色素A计算,不得低于4000。在本色谱条件下羟基红花黄色素A和红花黄色素A能达到较好分离,样品中其他成分对二者的测定无干扰。结果见图1。

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图1 对照品(A)和样品(B)的色谱图

Fig1 Chromatogramsofreferencesubstances(A)andsample(B)1.羟基红花黄色素A(safflominA) 2.红花黄色素A(saffloweryellowA)

111%和115%。

21315 加样回收试验 分别取已知含量(羟基红花黄色素A1012mg#g,红花黄色素A6122mg#g)的红花药材粉末012g,共6份,每3份为一组,精密称定,按低、高2个水平分别精密加入一定量对

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药物分析杂志ChinJPharmAnal2010,30(2))

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265)

照品(01751mg#mL羟基红花黄色素A对照品储

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备液217mL和310mL;014mg#mL红花黄色素A对照品储备液217mL和310mL),按/212120项下方法平行制备6份所需溶液,分别进样测定,结果见表1。羟基红花黄色素A和红花黄色素A的回收率(n=6)分别为10016%和10310%。

表1 加样回收试验结果(n=3)

Tab1 Resultofrecoverytestsample

成分(component)羟基红花黄色素A(safflominA)红花黄色素A(saffloweryellowA)

1124样品中含量

加入量

测得量

回收率

(sample(added)(found)(recovery)content)/mg/mg/mg/%2104

2103212511251139

4110413021532167

10015100161031510216

RSD/%1130166116111

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313 流动相的选择 有文献报道中国药典中羟

基红花黄色素A的HPLC测定方法的色谱峰形有较严重的拖尾现象,分离度也不理想。本实验流动相为参考文献[9~11]后自行试验摸索出来的。在选定的色谱条件下羟基红花黄色素A和红花黄色素A的分离令人满意。

参考文献

1

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10 TAOChun-mei(陶春梅),YUGuo-zhi(于国志),YUANLu(袁

璐),etal.ThedeterminationofsaffloryellowAinCarthamustinc-triusL.byHPLC(红花药材中红花黄色素A的HPLC测定).NorthwestPharmJ(西北药学杂志),2006,21(6):25411 TIANLan(田兰),WUGui-rong(吴桂荣),WANGYan(王岩),

etal.StudyontheHPLCfingerprintofhighqualityCarthamustinc-triusL.inEminTachengprefectureinXinjiang(HPLC指纹图谱法评价塔城地区额敏县优质红花内在质量).JXinjiangMedUniv(医科大学学报),2007,30(3):206

(本文于2009年8月16日修改回)

214 样品含量测定 分别取红花样品3份,按/212120项下方法制备供试品溶液。按上述色谱条件测定,外标法计算样品中羟基红花黄色素A和红

花黄色素A含量,结果见表2。

表2 样品含量测定结果(mg#g,n=3)

Tab1 Resultofcontentdeterminationofsamples

样品来源(samplesource)

塔城(Tacheng,Xinjiang)雅安三九药业GAP基地(YapanSanjiuPharmaceuticalXinjiangGAPBase)河南温县(Wenxian,Henan)四川简阳(Jianyang,Sichuan)

12121113

71626166

羟基红花黄色素A(safflominA)

10121219

红花黄色素A(saffloweryellowA)

61227145

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3 讨论

311 供试品溶液制备方法的确定 2005年版中国[8]

药典中规定红花含量测定的供试品提取溶剂为25%甲醇。经比较制备溶液,以水提取的羟基红花黄色素A、红花黄色素A的峰面积比例比25%甲醇提取的峰面积比例各高3%和2%左右。故选择水为提取溶剂。比较超声时间20,30,40,50min,发现20min和30min提取不完全,40min和50min提取率比较接近,考虑时间成本故选择40min。由于红花黄色素类物质的热不稳定性。故选择超声提取而不选择加热回流提取。

312 检测波长的选择 羟基红花黄色素A和红花黄色素A的特征吸收波长都在403nm左右。在403nm波长处,羟基红花黄色素A、红花黄色素A分离度好,各峰吸收明显,且无杂质峰干扰,故检测波长选择403nm。