２０１５年３月 基础医学与临床 Ｂａｓｉｃ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｍａｒｃｈ ２０１５ Ｖ０１．３５ Ｎｏ．３ 第３５卷第３期 文章编号：１００１—６３２５（２０１５）０３－０３９７—０２ 洛伐他汀对醛固酮诱导体外新生大鼠心肌成纤维细胞ＮＯ的 冯惠平 ，贾新未，王艳飞，张 芳，张兰芳，解俊敏 （河北大学附属医院心内科，河北保定０７１０００） 中图分类号：Ｒ ３２９．２８ 文献标志码：Ａ 心肌成纤维细胞（ｃａｒｄｉａｃ ｉｆｂｒｏｂｌａｓｔｓ，ＣＦｓ）增殖在心肌纤 维化中起重要作用。已有报道ＣＦｓ具有诱导型一氧化氮合 酶——一氧化氮（ｉＮＯＳ—ＮＯ）系统，其合成的ＮＯ是一种重要 的抗心肌纤维化因子 Ｊ。他汀类药物对醛固酮诱导的ＣＦｓ 的ｉＮＯＳ．ＮＯ系统活性是否有作用？尚未见报道。本文 实验观察了洛伐他汀干预条件下大鼠ＣＦｓ的ｉＮＯＳ—ＮＯ系统 活性的变化，为心肌纤维化的防治提供新的思路。 １材料与方法 １．１材料 １．１．１动物：出生２—３ ｄ的清洁级ＳＤ大鼠１８只，雌性１０ 只，雄性８只，河北医科大学动物中心，合格证号８０４０１０。 １．１．２试剂：洛伐他汀、醛固酮、四氮唑盐（ＭＴＩ＂）和胰蛋白 酶（Ｓｉｇｍａ公司）；ＤＭＥＭ培养基（Ｇｉｂｃｏ公司）；ＮＯ和ｉＮＯＳ 测定试剂盒（南京建成生物技术公司）。 １．２方法 １．２．１ ＣＦｓ的培养和鉴定：在无菌条件下取大鼠的心室， 采用胰蛋白酶消化法和差速贴壁法分离ＣＦｓ。待ＣＦｓ生长接 近汇合时以１：３传代。对ＣＦｓ进行ＳＡＢＣ法免疫组织化学 染色波形蛋白、纤维连接蛋白染色阳性和平滑肌肌动蛋白染 色阴性鉴定为所需的ＣＦｓ，纯度达９８％。实验用２～３代 细胞。 １．２．２实验分组：分为对照组、不同浓度的洛伐他汀组（１× １０～、１×１０～、１×１０Ｉ７和１×１０Ｉ８）和醛固酮（１×１０Ｉ７ ｍｏｌ／Ｌ） 组，细胞取自同批培养的ＣＦｓ。 １．２．３ ＭＴＦ比色法检测细胞增殖：将对数增殖期ＣＦｓ接种 在９６孔板中，每孔５×１０ 个细胞，在３ ｏＣ、５０ ｍｌ／Ｌ ＣＯ：及饱 和湿度下培养；２４ ｈ后换含１％血清ＤＭＥＭ培养液，继续孵 育２４ ｈ，使细胞进入生长静止期。弃上清液，分别加入各种 干扰因素继续培养４８ ｈ，每组设６个复孔。于培养结束前 ４ ｈ，加入ＭＴｒ（５ ｇ／Ｌ）２０ ＩｘＬ，在酶标仪上４９０ ｎｍ波长处测定 收稿日期：２０１４－０５—２７ 修回日期：２０１４－０９－２５ 基金项目：河北省卫生厅重点科技研究计划（２０１２０１３７） 通信作者（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕ￣ｏｒ）：ｔｌａｐ１２０８＠ｓｉｎａ．ｃｎ 吸光度值（Ａ 值）。 １．２．４ ｉＮＯＳ－ＮＯ系统活性测定： １）细胞培养液ＮＯ含量和ｉＮＯＳ的活力测定：ＣＦｓ培养至 近汇合状态时，１％血清ＤＭＥＭ培养液驯化２４ ｈ，分别加入培 养液和药物，孵育２４ ｈ，收集细胞培养液。采用还原酶 法检测细胞培养液中的ＮＯ含量，采用分光光度计法测定 ｉＮＯＳ活性。 ２）Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析ｉＮＯＳ蛋白表达：将２—３代的ＣＦｓ种 植于５０ ｍＬ培养瓶中增殖至亚汇合状态后，在含１％胎牛血 清ＤＭＥＭ培养液中培养２４ ｈ，然后加入不同浓度的洛伐他汀 作用２４ ｈ后观察ｉＮＯＳ蛋白表达。用ＳＤＳ缓冲液溶解并粉 碎细胞，９５℃加热５ ｍｉｎ使蛋白质变性，离心取蛋白质上清 液２０ Ｌ。用１０％ＳＤＳ聚丙烯酰胺电泳分离蛋白，电转仪转 移到纤维素膜（１００ Ｖ，１．５ ｈ）。５％脱脂奶粉４ ｏＣ过夜封 闭非特异结合部位，兔抗大鼠ｉＮＯＳ多克隆抗体（１：１００）室 温孵育２ ｈ，ＨＲＰ连接的二抗（１：２ ０００）孵育２ ｈ，ＤＡＢ显色。 采用Ｇｅ１．ｐｒｏ凝胶分析软件成像分析系统软件对Ｗｅｓｔｅｒｎ印 迹结果进行定量分析，吸光度值以积分光密度值（Ａ）表示。 １．３统计学分析：数据以均数±标准差（ ±ｓ）表示，应用 ＳＰＳＳ１１．０统计软件对资料进行分析。两组均数比较采用￡ 检验，多组均数比较采用方差分析和两两比较，两组数据相 关性采用直线相关分析。 ２结果 ２．１洛伐他汀对ＣＦｓ增殖的影响：在１×１０～、１×１０ 和 １×１０ ｍｏｌ／Ｌ洛伐他汀的作用下，Ａ值分别为０．３５６± ０．０１１、０．２８７±０．００８和０．２３１±０．００７，随着洛伐他汀浓度的 增加呈递减趋势。１×１０ ｍｏｌ／Ｌ洛伐他汀组的Ａ 值与１× １０一 ｍｏｌ／Ｌ醛固酮组Ａ４帅值比较差异无显著性。 ２．２洛伐他汀对醛固酮诱导ＣＦｓ的ＮＯ含量和ｉＮＯＳ活性 的影响：以１×１０一 ｍｏｌ／Ｌ醛固酮诱导ＣＦｓ ２４ ｈ为对照组，
