功能基因表达载体的构建

实验名称：功能基因表达载体的构建 11级水生生物 李雪静 1110170036 2010-1-20

一、 实验目的：构建功能基因kazal的表达载体。

二、实验流程：基因克隆——→小片段（kazal）制备、大片段制备——→kazal基因与目标

载体连接——→蛋白质的诱导表达

三、实验过程

（一）2012年6月6日上午：PCR扩增目的基因A

1.1 实验原理：PCR（polymerase chain reaction）技术是Kary Mullis 在1985年建立起来的

在细胞体外合成DNA的一种方法。依DNA半保留复制原理，利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的特性，在附加的两个引物与模板杂交之后，按碱基配对原则经酶促反应合成DNA片段，包括模板变性、引物退火及用DNA聚合酶延伸两个引物之间DNA的一定次数的重复循环，使包括在两个引物5′端限定的特异性片段形成指数式积累。整个过程操作简单，可在短时间内在小管中获得大量的特异的DNA拷贝，这一特点使PCR技术很快被应用到了分子生物学研究的广大领域。扩增DNA的特异性主要取决于引物和模板相结合的特异性，每个循环的反应分为3步：

（1）模板变性（template denaturation）：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成游离

于溶液中的单链DNA。

（2）退火（annealing）：温度突然降低，反应体系中的引物能准确地配对于被扩增区域的

两个侧翼。这是因为模板分子结构比引物的结构复杂得多，而且引物的拷贝数远高于模板DNA的拷贝数，因此引物与模板DNA形成复合物的概率要大大高于模板DNA两条单链的重新结合。

（3）延伸（extension）：在DNA聚合酶、4种脱氧核糖核苷三磷酸及Mg存在的条件下，

DNA聚合酶催化以引物为起始点的5′--3′DNA链延伸反应。n个循环后，一个模板得到的扩增拷贝为2-1。 1.2 实验步骤：

以菌液为模版，进行PCR反应，扩增目标基因。

n

2+

25μl反应体系为： 10× PCR buffer（Mg2+） 2.5µL dNTP 2 µL ExTaq DNA Polymerase 0.2µL 水（灭菌的去离子水） 15.875µL

模板 1µL 上游引物 1µL 下游引物 1µL

反应条件为：94℃，4min

94℃，1min

60℃，1min 25cycle 72℃，1min 72℃，10min

15℃，保温

（二）2012年6月7日 电泳检测kazal基因及回收

并把获得的kazal基因片段接入T载体

2.1电泳检测：

（1）称取0.2g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入30mL的蒸馏水和400µL TAE电泳缓冲液，

置微波炉中加热至液体完全澄清，取出后摇匀，冷却到50℃左右，加入EB 染料1µL，摇匀，使之完全溶解

（2）倒入插有梳子的制胶槽中(注意不要形成气泡)，凝胶厚度一般为1cm左右，室温冷却

30～40min。

（3）待胶凝固后，取出梳子并将凝胶放入电泳槽中，加入足够的1×TAE电泳缓冲液，覆盖

凝胶约1mm，用移液将已经加入3µL上样缓冲液的样品和Marker分别加入到加样孔中(记录点样顺序及点样量)。

（4）接通电泳仪电源(注意正负极，RNA片段从负极向正极移动)。 （5）30分钟左右后，将凝胶放入凝胶成像仪内观察、照相。

2.1.1实验结果：

2.2 割胶回收

（1）在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计

算凝胶重量（提前纪录1.5mL离心管重量），该重量作为一个凝胶体积（100mg=100µL体积）。

（2）加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75℃加热，间断混合（每2—

3min），直至凝胶完全熔化（6—8min）。

（3）加0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀。当分离的DNA片段小段小鱼

400bp时，需再加入1个凝胶体积的异丙醇。

（4）吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管（置于2mL离心管）中，1200 ×g，离

心1min，弃滤液。

（5）将制备管置于2mL离心管，加500µL Buffer W1，12000 ×g，离心30s，弃滤液。 （6）将制备管置回2mL离心管，加700µL Buffer W2，12000×g，离心30s，弃滤液。

以同样的方法再用700µL Buffer W2洗涤一次，12000 ×g，离心1min。（确认W2

中加入指定体积无水乙醇）

（7）将制备管置回2mL离心管中，12000×g，离心1min。

（8）将制备管置于1.5mL离心管中，在制备膜加25—30µL Eluent或去离子水，室温

静置1min，12000×g，离心1min。 2.3 T载体连接 （冰上操作）

5µL体系 solutionΙ 2.5µL DNA 2.1µL T载体 0.4µL

混匀后离心，16℃过夜培养。

（三）2012年6月8日上午： E.coli TOPO感受态细胞的制备 2012年6月8日下午：E.coli TOPO感受态细胞的转化

3.1制备感受态细胞

（1）取25g LB Broth Medium培养基，加入1L蒸馏水，加热溶解后分装在试管中（每管

3ml）。灭菌后冷却备用。

（2）摇菌：取保好的菌种50μl加入到3ml培养基（无Amp）中，37℃，180rpm，摇菌

过夜。

目的：使菌体充分生长，增加菌体的浓度

（2）菌种复摇：将前夜摇菌（37℃，180rpm，无Amp）拿出，抽100µL于3mLLB培养

基（无Amp）中，继续摇2—3h，当看到绸缎样取出。

目的：上述菌液经过摇菌一夜后，肯定过了对数生长期，所以为了获得对数生长期的菌液，须再在一个新的环境里摇1-2h，使还存活的菌继续生长达到对数期，而生长处于末期的菌在新的培养基里也不会存活。

（3）去1mL置于EP管中离心，3000rpm，3mim，倒去上清，若菌体少可在加1mL。 （4）超净工作台下，吸取残留上清，每EP管加100µL 预冷的Cacl2（0.1M）4℃轻柔反复

吹打，放入冰中再放入4℃冰箱，3h后可用。

（CaCl2的作用：在沉淀中加入CaCl2以后，Ca2+会形成羟基钙磷酸复合物，它可以吸

附在大肠杆菌细胞的表面，作用① 使大肠杆菌细胞膜膨胀，膜的流动性变差，呈现晶格状态，进而易使连接产物进入到细胞当中；② 抗DNA酶，防止把转化的DNA片段打断） 3.2 转化

（1）制培养基平板：已灭菌的LB培养基在摸着不烫手的时候，加入氨苄，之后倒平板。

（一般1ml培养基中加1μl氨苄母液，氨苄母液1ml溶液中有0.1g氨苄）

（2）将100µL感受态细胞和5—10µL连接物混匀，冰浴30min。 （2）42℃热击90s，迅速转移到冰浴中2-3min

（3）加800μl培养基（无Amp），培养箱中培养45分钟，条件：37℃，150rpm。

（目的：让菌进一步生长，扩大浓度）

（4）将摇好的菌3000rpm离心5min，弃掉900μl上清，用把剩下100μl上清与沉淀混

匀。在超净台中，取此菌液涂在平板上，37℃倒置培养。

（说明：因为T载体上有抗氨苄的基因，因此涂平板后，已转化成功的大肠杆菌感受态细

胞可生长成为单克隆菌落，未转化成功的将不会生长。

注意：① 感受态最好现用现制，最多不能超过24h，但如果为了避免每次现用现制太麻

烦而制了一大批，则可以把它放入液氮中速冻，然后取出保存在-80℃的冰箱里，使用期限为1个月；

② 摇菌震荡的时候，大的试管和锥形瓶可以垂直放着摇，但小的管则要水平放置着摇，这样才会摇的比较均匀充分；

③ 在平板中培养菌体时，平板要倒置，防止蒸发的水分落在平板的菌落上） （四）2012年6月9日上午挑克隆 （1）将3μl Amp加入3ml LB培养基中。

（2）将加入Amp的LB培养基分至6个EP管中，每管500μl。

（3）将过夜培养的平板取出，在超净工作台中，用黄色头挑一个单克隆菌落，在（2）

中的培养基中蘸一下。

（4）摇菌37℃，180rpm，4-5h后检测。

（五）2012年6月9日下午 PCR扩增检测克隆Kazal基因 电泳检测 2012年6月10日 摇菌保种 5.1 PCR反应检测Kazal基因

25μl反应体系为： 混合液（buffer，loading，mg2+，酶） 12.5µL 水（灭菌的去离子水） 10µL

模板 （菌液） 1µL 上游引物 1µL 下游引物 1µL

反应条件为：94℃，4min

94℃，1min

60℃，1min 25cycle 72℃，1min 72℃，10min

15℃，保温 5.2电泳检测：

（1）称取0.2g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入30mL的蒸馏水和400µL TAE电泳缓冲液，

置微波炉中加热至液体完全澄清，取出后摇匀，冷却到50℃左右，加入EB 染料1µL，摇匀，使之完全溶解

（2）倒入插有梳子的制胶槽中(注意不要形成气泡)，凝胶厚度一般为1cm左右，室温冷却

30～40min。

（3）待胶凝固后，取出梳子并将凝胶放入电泳槽中，加入足够的1×TAE电泳缓冲液，覆盖

凝胶约1mm，用移液将PCR反应产物和Marker分别加入到加样孔中(记录点样顺序及点样量)。

（4）接通电泳仪电源(注意正负极，RNA片段从负极向正极移动)。 （5）30分钟左右后，将凝胶放入凝胶成像仪内观察、照相。 实验结果：

条带大小与目标基因的大小一致，即可确定其为Kazal基因。

5.3保种

（1）取3ml LB培养基，加入3μl Amp和80μl菌液。37℃，180rpm培养。

（2）摇菌4-5h，当试管中的液体呈绸缎状时，从中取出1ml加入200μl灭菌的甘油，混匀

后-20℃保存。其余菌液继续摇，摇到很浓时取出1ml送测序。 （六）2012年6月10日晚 摇菌

（1）LB培养基+氨苄 TOPO10菌种 取保种的TOPO菌液50μl加入3ml培养基中，

37℃，180rpm，培养过夜（这种质粒含有氨苄抗性基因）

（2）LB培养基+氨苄 若目的基因测序正确，则从对应所保菌种中取50μl加入3ml培养

基中，37℃，180rpm，培养过夜。（目的基因连载T载体上，载体上有氨苄抗性基因。）

（七）2012年6月11日下午：提取质粒及双酶切 7.1质粒提取

（1）柱平衡步骤：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500μl的平衡液BL，

12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

（2）取1-5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12000rpm离心

1min，尽量吸除上清。

（3）向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1（请检查是否已加入RNaseA），使用

移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。

注意：如果有为彻底混匀的菌块，会影响裂解，倒置提取量和纯度偏低。 （4）向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充解。

注意：温和地混匀，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有

基因组DNA片段。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒收到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。 （5）向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出

现白色絮状沉淀，12000rpm离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。

注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，

可再次离心后去上清。

（6）将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），注意

尽享不要吸出沉淀，12000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

（7）向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm

离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。 （8）重复操作步骤7

（9）将吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液

除去。

注意：票写后在那个乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切，PCR等）实验，为确保

下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CP3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液，

（10）将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μl洗脱

缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm离心2min将质粒溶液收集到离心管中。 注意：洗脱缓冲液体积不应少于50μl，体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对

于洗脱效率有很大影响。若后续做测序，需使用去离子水做洗脱液，并保证pH值在7.0-8.5范围内（可以用NaOH将水的pH调到此范围），pH低于7.0会降低洗脱效率。且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。为了增加质粒的回收率，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心2min，将质粒溶液收集到离心管中。 7.2双酶切

双酶切体系（50μl）

ddH2O 20μl

10×K Buffer 5μl（不同的酶需要用不同的Buffer，可以通过查相应表得

知，今天用的两种酶查表得它们的交点为1×K Buffer，但买来的为10×K Buffer，按比例稀释即可）

提取的质粒 20μl

BamHⅠ 2.5μl G↓GATCC 酶切温度37℃ HindⅢ 1μl A↓AGCTT 酶切温度30℃

33-34℃酶切4h

7.4目的片段与TOPO10质粒连接

（1）酶切4h后跑电泳，进行割胶回收。

单数孔道上部的条带为T载体，分子量大于2kb，下面的条带为Kazal基因，分子量在4590bp左右，条带均比较窄。双数数孔道未经酶切，因此在500-750bp之间无Kazal基因的条带，且它的条带比较宽，因为其呈超螺旋结构。

M 1 2 3 4 5 6 （2）将目的基因与TOPO10载体连接 连接体系（20μl）

10× TH DNA ligase buffer 2μl

Kazal片段 15μl TOPO10（大片段） 2μl T4 DNA ligase 1μl

16℃连接过夜。

其后过程为制备感受态细胞、感受态细胞的转化、挑单克隆、PCR扩增、电泳检测、保种、测序。测序结果正确，将构建好的表达载体转入大肠杆菌中大量表达蛋白质。