(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 112710773 A(43)申请公布日 2021.04.27
(21)申请号 202011482401.7(22)申请日 2020.12.16
(71)申请人 中国环境科学研究院
地址 100012 北京市朝阳区安外大羊坊8号(72)发明人 曾萍 王良杰 成璐瑶 宋永会
李娟 (74)专利代理机构 重庆卓茂专利代理事务所
(普通合伙) 50262
代理人 许冲(51)Int.Cl.
G01N 30/96(2006.01)
权利要求书1页 说明书4页 附图4页
(54)发明名称
一种采用离子色谱法同时检测磷霉素及其二醇物的方法(57)摘要
本发明属于化学物质分析检测技术领域，公开了一种采用离子色谱法同时检测磷霉素及其二醇物的方法。本发明采用离子色谱法同时检测磷霉素及其二醇物的方法包括如下步骤：(1)离子色谱仪器及色谱测试条件的选择：色谱柱为低容量氢氧根体系阴极保护柱，抑制器采用电解的膜抑制器，淋洗液为NaOH或KOH溶液；(2)以磷霉素钠为标准品绘制磷霉素标准曲线；(3)以磷霉素氨丁三醇EP杂质A为标准品绘制磷霉素二醇物标准曲线；(4)测试并获得样品中磷霉素和其二醇物的峰面积，代入标准曲线后获得相应的浓度。本发明的方法具有重现性好、检出限低、灵敏度高、操作简单和所用离子色谱设备使用广泛等优点，可以同时测试磷霉素和其二醇物。
CN 112710773 ACN 112710773 A
权 利 要 求 书
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1.一种采用离子色谱法同时检测磷霉素及其二醇物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)离子色谱仪器及色谱测试条件的选择：色谱柱为低容量氢氧根体系阴极保护柱，抑制器采用电解的膜抑制器，淋洗液为NaOH或KOH溶液；
(2)磷霉素标准曲线绘制：配制不同浓度的磷霉素钠标准溶液，利用自动进样器进样，以外标法进行定量分析，对磷霉素的浓度和所测得的磷霉素的峰面积进行线性回归分析；
(3)磷霉素二醇物标准曲线绘制：配制不同浓度的磷霉素二醇物溶液，利用自动进样器进样，以外标法进行定量分析，对磷霉素二醇物的浓度和所测得的磷霉素二醇物的峰面积进行线性回归分析；
(4)样品中磷霉素及其二醇物含量的测定：对于固体药品，先将其溶解配制成溶液，所配制溶液的浓度要在标准曲线范围内，而对于水样，通过调整稀释倍数，使其浓度处在标准曲线范围内，经检测获得磷霉素的峰面积和其二醇物的峰面积后，采用外标法定量，将所测得的峰面积代入一元线性回归方程，计算出待测样品中磷霉素和磷霉素二醇物的浓度。
2.根据权利要求1所述的采用离子色谱法同时检测磷霉素及其二醇物的方法，其特征在于，所述色谱柱为Dionex IonPacTMAS11‑HC阴离子柱。
3.根据权利要求1所述的采用离子色谱法同时检测磷霉素及其二醇物的方法，其特征在于，所述抑制器为ASRS300。
4.根据权利要求1所述的采用离子色谱法同时检测磷霉素及其二醇物的方法，其特征在于，所述NaOH或KOH溶液的浓度为8‑10mmol/L。
5.根据权利要求1所述的采用离子色谱法同时检测磷霉素及其二醇物的方法，其特征在于，所述离子色谱法中参数设置为：进样量25μL，柱温25‑35℃，流速0.8‑1.0mL/min，抑制器电流为20‑25mA，分析时间13min以上。
6.根据权利要求5所述的采用离子色谱法同时检测磷霉素及其二醇物的方法，其特征在于，所述抑制器电流数值是淋洗液浓度数值的2.5倍。
7.根据权利要求1所述的采用离子色谱法同时检测磷霉素及其二醇物的方法，其特征在于，所述步骤(2)中磷霉素钠的浓度为0.0025mmol/L到1.0mmol/L。
8.根据权利要求1所述的采用离子色谱法同时检测磷霉素及其二醇物的方法，其特征在于，所述步骤(3)中磷霉素二醇物的浓度为0.02mmol/L‑1.0mmol/L。
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一种采用离子色谱法同时检测磷霉素及其二醇物的方法
技术领域
[0001]本发明涉及化学物质分析检测技术领域，具体是涉及一种采用离子色谱法同时检测磷霉素及其二醇物的方法。
背景技术
[0002]近年来，多重耐药菌、泛耐药菌，甚至全耐药菌感染不断出现，给临床感染疾病的诊治带来了严峻挑战。而研究证实磷霉素因其独特的抗菌机制对耐药菌具有良好的抗菌活性，因此，磷霉素在临床抗感染治疗中十分受重视。然而，在磷霉素生产的不同环节下，会产
会引发环境中细菌生不同浓度的磷霉素废水，磷霉素作为一种抗生素，排放到自然水体中，
的耐药性对生态环境和人体健康造成威胁。因此，很有必要测定不同生产环节下产生的磷霉素废水中磷霉素的含量，以选取最佳处理方法。[0003]在《中国药典》中，采用抗生素微生物检定法对磷霉素进行检测，该方法可批量测定磷霉素含量，但操作过程相对复杂，耗时较长，易受到其它抗生素的干扰，缺乏专一性和精确度。紫外‑可见分光光度法具有操作简单，灵敏度相对较高的优点，但磷霉素在大于220nm处无紫外‑可见吸收，因此常规的紫外‑可见分光光度法无法对其检测。采用茜素作为显色剂后，可采用紫外‑可见分光光度法对磷霉素进行测试，乙醇溶液中磷霉素与茜素复合后，在545nm处有很强的吸收峰，对磷霉素的检测限可达1.4mg/L左右，此方法用于无颜色的样品检测时具有一定优势，但磷霉素废水成分复杂，色度大，会导致磷霉素与茜素体系的显色性差，且还会产生沉淀。高效液相色谱法也可测定磷霉素的浓度，但是其检出限高，不适用于低浓度磷霉素废水的测试。[0004]为克服上述方法的缺陷，中国专利文献CN103728385A中提出了一种用离子色谱法检测磷霉素的方法，该方法可快速准确地检测出磷霉素废水中磷霉素的含量，且检出限可达0.06mg/L。然而，磷霉素的化学结构中包含一个环氧基团，其稳定性较差，易水解形成磷霉素二醇物。因此，在磷霉素废水中，不仅含有磷霉素，同时含有磷霉素二醇物。中国专利文献CN103728385A中提出的用离子色谱法检测磷霉素的方法无法将磷霉素和磷霉素二醇物区分开(磷霉素和磷霉素二醇物出峰时间很相近)，因此在磷霉素废水或者其它样品中，当磷霉素和磷霉素二醇物共存时，该方法不但不能同时将磷霉素和磷霉素二醇物检测出，还会影响磷霉素测试的准确性。因此，很有必要开发一种快速准确且检出限低的方法来同时测定磷霉素和磷霉素二醇物的含量。
发明内容
[0005]本发明的目的是为了克服上述背景技术的不足，提供一种采用离子色谱法同时检测磷霉素及其二醇物的方法。[0006]为达到本发明的目的，本发明采用离子色谱法同时检测磷霉素及其二醇物的方法包括如下步骤：[0007](1)离子色谱仪器及色谱测试条件的选择：色谱柱为低容量氢氧根体系阴极保护
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柱，抑制器采用电解的膜抑制器，淋洗液为NaOH或KOH溶液；[0008](2)磷霉素标准曲线绘制：配制不同浓度的磷霉素钠(CAS号：25162‑71‑4)标准溶液，利用自动进样器进样，以外标法进行定量分析，对磷霉素的浓度和所测得的磷霉素的峰面积进行线性回归分析；[0009](3)磷霉素二醇物标准曲线绘制：配制不同浓度的磷霉素氨丁三醇EP杂质A(CAS号：84954‑80‑3)标准溶液，即不同浓度的磷霉素二醇物溶液，利用自动进样器进样，以外标法进行定量分析，对磷霉素二醇物的浓度和所测得的磷霉素二醇物的峰面积进行线性回归分析；[0010](4)样品中磷霉素及其二醇物含量的测定：对于固体药品，先将其溶解配制成溶液，所配制溶液的浓度要在标准曲线范围内，而对于水样，通过调整稀释倍数，使其浓度处
经检测获得磷霉素的峰面积和其二醇物的峰面积后，采用外标法定量，在标准曲线范围内，
将所测得的峰面积代入一元线性回归方程，计算出待测样品中磷霉素和磷霉素二醇物的浓度。
[0011]进一步地，所述色谱柱为Dionex IonPacTMAS11‑HC阴离子柱(优选250×4mm,Dionex,USA)。
[0012]进一步地，所述抑制器为ASRS300。[0013]进一步地，所述NaOH或KOH溶液的浓度为8‑10mmol/L。[0014]进一步地，所述离子色谱法中参数设置为：进样量25μL，柱温25‑35℃，流速0.8‑1.0mL/min，抑制器电流为20‑25mA，分析时间13min以上。[0015]进一步地，所述抑制器电流数值(以mA计)是淋洗液浓度数值(以mmol/L计)的2.5倍。
[0016]进一步地，所述步骤(2)中磷霉素钠的浓度为0.0025mmol/L到1.0mmol/L。[0017]进一步地，所述步骤(3)中磷霉素二醇物的浓度为0.02mmol/L‑1.0mmol/L。[0018]本发明中，磷霉素的定量限为0.0025mmol/L，磷霉素二醇物的定量限为0.02mmol/L；磷霉素的检出限为0.0005mmol/L，磷霉素二醇物的检出限为0.0004mmol/L；磷霉素出峰时间在9.6‑9.7minmin，磷霉素二醇物出峰时间在8.4‑8.5min。[0019]与现有技术相比，本发明采用离子色谱法同时检测磷霉素及其二醇物的方法具有重现性好、检出限低、灵敏度高、操作简单和所用离子色谱设备使用广泛等优点。附图说明
[0020]图1是实施例1中磷霉素的出峰时间；
[0021]图2是实施例1中磷霉素二醇物的出峰时间；[0022]图3是实施例1中磷霉素的标准曲线；
[0023]图4是实施例1中磷霉素二醇物的标准曲线；
[0024]图5是实施例1中稀释2000倍后磷霉素废水的离子色谱图；[0025]图6是10mmol KOH淋洗下磷霉素和其二醇物混合液的离子色谱图；[0026]图7是30mmol NaOH淋洗下磷霉素实际废水的离子色谱图；[0027]图8是20mmol NaOH淋洗下磷霉素和其二醇物混合液的离子色谱图。
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具体实施方式
[0028]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。以下描述仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0029]本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
[0030]实施例1
[0031]磷霉素制药废水中磷霉素及其二醇物的检测：[0032]所用色谱柱为Dionex IonPacTMAS11‑HC阴离子柱(250×4mm,Dionex,USA)，所用抑制器为ASRS300，所用离子色谱条件参数为：进样量25μL、柱温30℃、流速1.0mL/min、淋洗液为10mmol/L的NaOH溶液、抑制器电流25mA、每个样品的分析时间为60min。[0033]以磷霉素钠配置不同浓度(0.0025mmol/L‑1.0mmol/L)的溶液，用于获取磷霉素的标准曲线；以磷霉素氨丁三醇EP杂质A磷霉素二醇物(0.02mmol/L‑1.0mmol/L)配置不同浓
用于获取磷霉素二醇物的标准曲线。度的溶液，
[0034]取磷霉素废水，过0.22μm滤膜后稀释2000倍，取3个5mL离子色谱进样瓶，分别加入5mL稀释后的样品，作为三个平行样品。[0035]运行离子色谱仪，待基线稳定后，利用自动进样器进样，对不同浓度的标准品溶液和磷霉素废水水样进行测试。磷霉素的出峰时间如附图1所示，磷霉素二醇物的出峰时间如附图2所示。
[0036]以标准品溶液的浓度和所测得的峰面积绘制标准曲线，获得线性回归方程。磷霉素的标线如表1和附图3所示，其定量限为0.0025mmol/L。[0037]表1实施例1中磷霉素的标准曲线
[0038]
[0039][0040][0041]
磷霉素二醇物的标线如表2和附图4所示，其定量限为0.02mmol/L。表2实施例1中磷霉素二醇物的标准曲线峰面积，μS*min6.36983.01281.09
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磷霉素浓度，mmol/L10.50.2
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0.50210.10.23760.050.09260.02
[0042]磷霉素废水测试离子色谱图如附图5所示，将所测得的磷霉素废水中的磷霉素和磷霉素二醇物的峰面积分别代入各自的标准曲线中，计算获得磷霉素废水中磷霉素和磷霉素二醇物的浓度，结果见表3。
[0043]表3实施例1中磷霉素废水中磷霉素和磷霉素二醇物的浓度
磷霉素浓度，mmol/L磷霉素二醇物浓度，mmol/L样品1112.6967.8样品2114.6940.4样品3111.0953.7平均值112.53.9标准偏差1.813.7
[0045]实施例2
[0046]以10mmol/L的KOH溶液为淋洗液，其余测试条件与实施例1相同，对配制的同时含有磷霉素二醇物和磷霉素的混合液进行检测，由图6可以看出，两种物质的出峰没有互相影响，可以良好的根据峰面积算出两种物质的浓度。[0047]对比例1
[0048]图7为磷霉素实际废水的离子色谱图，采用30mmol/L的KOH淋洗液和75mA的抑制器电流，其余条件与实施例1相同。根据图7可以看出，磷霉素二醇物和磷霉素的出峰时间相近，无法很好的分离开，因此无法准确检测磷霉素实际废水中磷霉素二醇物和磷霉素的浓度。
[0049]对比例2
[0050]图8为配制的同时含磷霉素和磷霉素二醇物的混合液的离子色谱图，检测所用条件除NaOH淋洗液的浓度换为20mmol/L和抑制电流为50mA外，其余条件与实施例1相同。根据图8可以看出，磷霉素的出峰被氯离子影响，而氯离子为实际废水中常见无机阴离子。因此，此条件下无法同时准确检测磷霉素二醇物和磷霉素的浓度。[0051]本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的示例而已，并不用以本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0044]
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图2
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