检测分析
食品研究与开发2010年11月第31卷第11期
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HPLC法检测柑橘中赤霉酸残留量的色谱条件
2，*
包琴1，唐洁1，，马力1，祝瑞博2，姚开2
（1.西华大学生物工程学院，四川成都610039；2.四川大学轻纺与食品学院，四川成都610065）
摘
要：在确定了赤霉酸适宜检测波长的基础上，以保留时间、分离度、拖尾因子、谱图峰型、相对标准偏差等为指标，
分别考察流动相甲醇与水的体积比、流动相流速及柱温对柑橘中赤霉酸检测结果的影响。结果显示，采用反相C18柱的HPLC法检测赤霉酸的适宜色谱条件为：柱温为35℃，流动相为体积比为40/60的甲醇-水溶液（pH4.0），流速为1.0mL/min，检测波长为210nm。在此条件下，HPLC检测柑橘中赤霉酸含量的灵敏度高（最低检出限0.0334μg，S/N=3），准确度较好（平均加标回收率为86.0%~91.0%，n=5），精密度较高（平均RSD为1.4097%，n=5）。关键词：赤霉酸（GA3）；残留量；柑橘；HPLC；色谱条件
ChromatographicConditionsoftheDeterminationofGA3ResidueinCitrusbyHPLC
BAOQin1,TANGJie1,2,*,MALi1,ZHURui-bo2,YAOKai2
（1．BioengineerSchool，XihuaUniversity，Chengdu610039，Sichuan,China；2．CollegeofLightIndustryandFood，
SichuanUniversity，Chengdu610065，Sichuan,China）
Abstract:Studythewavelength,ratioofmethanolandwater,flowrateandcolumntemperatureonthedeterminationofGA3residueincitrusbyHPLC,bytheindexofretentiontime,resolution,tailingfactor,peak,andRSDetal.TheresultshowedtheoptimumchromatographicconditionsofHPLCwere:C18column;columntemperature35℃;mobilephase:CH3OH/H2O=40/60（pH4）;flowrate1.0mL/min;wavelength210nm.Undertheseexperimentalconditions,themethodofdeterminationofGA3byHPLCissensitive（thelimitofdetection：0.0334μg,S/N=3）,accurate（therecoveryofstandardaddition:86.0%-93.4%,n=5),precise（RSD:1.4097%,）.n=5
Keywords:gibberellinacid（GA3）;residue;citrus;HPLC;chromatographicconditions
赤霉素为双萜类植物内源激素（见图1），分子式为C19H22O6，相对分子质量为346.37，易溶于醇类、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂，可溶于碳酸氢钠和pH6.2的磷酸缓冲溶液，酸性条件下稳定，遇碱易分解[1]。赤霉素主要是通过赤霉菌的发酵作用进行工业化生现已产[2]。自1926年首次于水稻中发现赤霉素以来，从高等植物和微生物代谢产物中分离出100余种赤）的生理活性最强。长期以来，霉素，其中赤霉酸（GA3赤霉素被认为是一种高效低毒的植物生长激素，对植物生长发育的各个阶段均具有调节作用，尤其对果蔬
基金项目：西华大学食品生物技术省高校重点实验室项目资助作者简介：包琴（1987—），女（汉），硕士研究生，研究方向：食品安全与检测。
*通信作者：唐洁（1982—），女（汉），讲师，博士研究生，研究方向：食品安全。
图1赤霉素的化学结构
Fig.1Thechemicalstructureofgibberellin
有显著的增产效果[3]。然而，由于大量和广泛使用，导致果蔬等农作物中赤霉素的残留量严重超标[4]。近年来的研究表明，赤霉素也可在动物体内蓄积，增加肿瘤形成和氧化应激反应的几率，饲喂赤霉素大鼠的皮肤和膀胱均有炎症反应，并引发肿瘤的形成[5]。由此表明，赤霉素对人体健康有一定的潜在危害性。美国、日本等国家已规定水果中赤霉素的最高残留限量为
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0.2μg/g[6]。目前，赤霉素的检测方法主要有酶联免疫法、分光光度计法、薄层荧光法和气相色谱法等[7-8]。本文采用高效液相色谱法对柑橘中赤霉酸的残留量进行了检测，旨在为果蔬中赤霉素类植物生长调节剂的准确快速测定提供参考。1材料与方法1.1
仪器与设备
SHIMADZULC20高效液相色谱仪:日本岛津仪器公司；
KQ-100DE数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；RE-52B旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；pHS-3C酸度计：方舟科技；旋涡混合器XW-80A：上海金鹏分析仪器有限公司；等。1.2
化学试剂
赤霉酸标准品（纯度99%）：由江西新瑞丰生化有限公司提供；甲醇（色谱纯）：FisherScientific公司产品；其它均为国产分析纯试剂。1.3
样品前处理方法
1）准确称取去皮柑橘样品300g，捣碎后加入其体积3倍的甲醇，匀浆化处理，4℃振荡过夜，过滤，残渣中加入1倍体积的甲醇，
超声（40kHz，100W，25℃）振荡5min，过滤，依此再重复1次，合并3次滤液，得柑橘的甲醇提取液。
2）将柑橘的甲醇提取液中加入0.5倍体积的石油醚，放在旋涡混合器上充分振荡30s，重复3次，将脱色后的柑橘提取液于45℃真空浓缩至约20mL。
3）用稀盐酸调节脱色后的柑橘提取液pH至2.5~2.8，加入等体积的乙酸乙酯，放在旋涡混合器上充分振荡30s，静置后收集乙酸乙酯相，重复三次，合并有机相，于45℃真空浓缩至约20mL。
4）将乙酸乙酯萃取液中加入等体积pH7.0的磷酸盐缓冲溶液进行反萃取操作[9]，
放在旋涡混合器上充分振荡30s，静置后分离乙酸乙酯相，重复3次，合并反萃取液，稀盐酸调其pH至2.5~2.8。
5）将反萃取液中加入0.5倍体积的乙酸乙酯，放在旋涡混合器上充分振荡30s，静置后分离乙酸乙酯相，重复3次，合并有机相，于45℃真空浓缩并挥干溶剂。用2.0mL甲醇（色谱纯）复溶后作为待测样品。1.4色谱条件的选择1.4.1
最大吸收波长的选择
配制浓度为200μg/mL的赤霉酸标准溶液，采用ComatexC18色谱柱（5μm,4.6mm×25cm），进样量为10.0μL，柱温为35℃，流动相为甲醇-水溶液（40/60，
体积比，用0.1mol/L磷酸调其pH为4.0）[10]
，流速为
1mL/min，选用二极管阵列紫外检测器对赤霉酸进行
全波段扫描，以确定其适宜的检测波长。1.4.2
其它色谱条件的选择
以赤霉酸的保留时间、
拖尾因子、分离度为指标，其它条件不变，分别考察流动相甲醇与水的体积比、流动相流速及柱温对赤霉酸检测结果的影响。数据分析采用LC-Solution工作站。1.5
标准曲线方程的建立
定量称取赤霉酸标准品，甲醇（色谱纯）溶解并定容，配制成赤霉酸含量为1000μg/mL标准溶液，稀释后得到其系列浓度的标准液：10、20、40、80、160、320、0μg/mL，用0.1mol/L盐酸分别调节其pH至2.5~2.8。在确定的HPLC色谱条件下，
分别进样20μL进行检测，绘制赤霉酸浓度与色谱峰面积的标准曲线，拟合后得到其标准曲线方程。1.6柑橘中赤霉酸的检测
将前处理后得到的柑橘样品待测液过0.45μm滤膜，进样5.0μL，HPLC法检测其赤霉酸含量。1.7加标回收率的测定
将前处理后得到的柑橘样品待测液中分别添加赤霉酸标准品，添加量分别为样品中赤霉酸含量的0.5倍、1倍、2倍。在确定的HPLC色谱条件下，分别进样20μL进行检测，平行重复5次，依据下式计算加标回收率及其RSD，
以评价方法的精密度及准确度。加标回收率=[(加标后样品液GA3含量－样品液GA3含量)/加标量]×100%2结果与讨论2.1色谱条件的确定2.1.1
检测波长的确定
赤霉酸的化学结构决定其在200nm~400nm的紫外光区有特征吸收，采用紫外检测器对其标准溶液进行全波段扫描的结果如图2所示。
图2赤霉酸的紫外扫描光谱图
Fig.2FigureofultravioletspectrumviewofGA3
由图2可以看出，赤霉酸于200nm~225nm有较
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大响应，与周艳明等（206nm）[3]、唐根源等（210nm）[11]
、杨彤等（200nm）[12]的研究结果相似。考虑到本试验的
流动相有甲醇，其透过波长的下限为210nm，低于此波长时溶剂的吸收会明显增强，对赤霉酸的检测造成干扰，故选用210nm作为其检测波长。2.1.2
流动相的确定
HPLC法检测赤霉酸多采用甲醇-水溶液作为流动相，如GrolamysCastillo等采用体积比为30/70的甲醇-水溶液[13]、湛社霞等采用体积比为35/65的甲醇-水溶液（NH4Ac-HAc）[6]。也有采用乙腈-水溶液作为
HPLC法检测赤霉酸的流动相，但乙腈的毒性较强，且价格昂贵。本试验比较了甲醇-水不同体积比（30/70、35/65、40/60）的流动相检测赤霉酸（标准品）的效果，结果如图3所示。
甲醇-水=30/70
甲醇-水=35/65
甲醇-水=40/60
图3甲醇-水不同体积比流动相的赤霉酸HPLC谱图
Fig.3HPLCChromatogramofGA3withdifferentratioof
methanol-water
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由图3可以看出，当甲醇-水的体积比为30/70时，尽管分离度较高（R=6.808），但赤霉酸的保留时间较长（16.526min），且有拖尾现象（T=1.923）；当甲醇-水的体积比为35/65时，分离效果仍较好（R=5.448），赤霉酸的保留时间为10.725min，但仍有拖尾现象（T=1.696）；当甲醇-水的体积比为40/60时，仍有较好的分离效果（R=2.098，≥1.5），且保留时间适中（7.565min），峰型对称性好（T=0.980）。由此确定40/60体积比的甲醇-水溶液为适宜的流动相。2.1.3柱温的确定
色谱柱温度会影响待测物与流动相和固定相之间的分配和吸附，也会影响流动相的粘度，进而影响其保留时间和峰型[14]。不同柱温检测赤霉酸的结果显示如图4。
30℃
35℃
40℃
图4不同柱温的赤霉酸HPLC谱图
Fig.4HPLCChromatogramofGA3indifferentcolumn
temperature
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当柱温为30℃时，赤霉酸保留时间为8.196min，分离度为3.830，拖尾因子为1.779；当柱温为35℃时，其保留时间为7.565min，分离度为2.098，拖尾因子为0.980；当柱温为40℃时，其保留时间为6.865min，分离度为2.955，拖尾因子为1.0。由此可见，尽管柱温在30℃、40℃时分离度也较高，但GA3峰有拖尾现象，而35℃时分离度较高，且峰型美观不拖尾，因此35℃是HPLC法检测赤霉酸的适宜柱温。2.1.4
流动相流速的确定
一定范围内，流动相流速降低，柱效提高，分离度增大；流速升高，保留时间短，但分离效果变差；过高的流速还会损坏泵头和色谱柱[15]。不同流动相流速检测赤霉酸的结果见图5。
0.8mL/min
1.0mL/min
1.2mL/min
图5不同流速的赤霉酸HPLC谱图
Fig.5HPLCChromatogramofGA3indifferentflowrate
图5显示，当流速为0.8mL/min时，其保留时间为9.204min，分离度为3.599，但峰型较宽有拖尾（T=1.866）；当流速为1.0mL/min时，其保留时间为7.565min，分离度为2.098，峰型对称性好，无拖尾（T=0.980）；当流速为1.2mL/min时，保留时间较短（6.105min），不利于样品中各组分的完全分离（R=1.075），且峰型对称性较差（T=2.456）。由此确定1.0mL/min为流动相的适宜流速。2.2
赤霉酸的标准曲线方程
基于以上试验结果，
HPLC法检测赤霉酸的适宜色谱条件为：反相C18柱，流动相为40/60（体积比）甲醇-水溶液（pH4.0），流速为1.0mL/min，柱温为35℃，检测波长为210nm。在确定的色谱条件下，检测浓度为200μg/mL赤霉酸标准样品的HPLC谱图如图5所示。可以看出，其流出曲线呈高斯曲线分布，具有集中性、有限性、对称性的特点。由此建立的赤霉酸标准品浓度（X）与色谱峰面积（Y）的标准曲线方程为：Y=25921X-34408
（R2=0.9999）。结果表明，该标准曲线方程的线性关系好，线性范围为10μg/mL~0μg/
mL，
其最低检出限为0.0334μg（S/N=3）[16]
。2.3
柑橘样品中的赤霉酸含量
取前处理后的柑橘样品液，进样量为5.0μL，
在确定的色谱条件下检测其赤霉酸含量，结果如图6所示。
图6赤霉酸标准品HPLC谱图
Fig.6HPLCChromatogramofthestandardofGA3
由图6可以看出，赤霉酸的保留时间为7.765min，与其它组分的分离效果较好。根据其峰面积（9884211）和标准曲线方程，计算得到5.0μL柑橘样品液中的赤霉酸含量为1.91324μg，换算得到柑橘样品的赤霉酸含量为2.551μg/g。2.4检测方法的评价2.4.1
加标回收率
在确定色谱条件下，按1.7所述方法对柑橘样品
液进行加标回收试验，结果见表1。可以看出，不同添加倍数赤霉酸的平均加标回收率为86.0%~91.0%，
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图7柑橘样品液的HPLC谱图
Fig.7HPLCChromatogramofcitrussample
表1柑橘样品液的加标回收率
Table1Therecoveryofstandardadditionofcitrussample赤霉酸添加倍数0.512重复检测次数555平均加标回收率/%
86.093.491.0RSD/%
1.32
0.79
1.1608
RSD为0.79%~1.32%，说明采用该色谱条件检测柑橘中赤霉酸含量的准确度较高。2.4.2精密度
取前处理后的柑橘样品液，在确定色谱条件下检测其赤霉酸含量，重复进样5次，每次5.0μL，根据赤霉酸峰面积和标准曲线方程计算其含量，结果见表2。
表2HPLC法重复5次检测柑橘样品液赤霉酸的结果
Table2TheresultsofthedeterminationofGA3incitrussample
byHPLC(n=5)检测次数12345赤霉酸峰面积981412098842639856372983931610156744赤霉酸含量/μg1.9721.913251.907871.904581.96581S值/%0.027041RSD/%1.4097由S值和RSD值可以看出，采用该色谱条件检测柑橘中赤霉酸含量的精密度高，结果可信。3结论
通过考察保留时间、分离度、拖尾因子、谱图峰型、相对标准偏差等指标，确定了HPLC法检测柑橘中赤霉酸的色谱条件。结果显示，
在适宜的色谱条件下，赤霉酸保留时间适中，与杂质的分离效果好，灵敏度、准确度、精密度均较高。研究结果可为果蔬中赤霉素
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类植物生长调节剂的准确快速检测提供参考。参考文献：
[1]叶文炳,徐凤宝,郭继文,等.GB15955-1995:赤霉素原药[S].北京:中国标准出版社,1995:657-660
[2]
RuchiShukla,SubhshChand,AshokKSrivastava.Improvementofgibberellicproductionusingamodelbasedfed-batchcultivationofGibberellafujikuroi[J].Processbiochemistry,2005(40):2045-2050[3]周艳明,汤媛,牛森.高效液相色谱法检测草莓中赤霉素残留量
的研究[J].食品工业科技,2009,30(1):311-321[4]
湛社霞,孙世宏,臧李纳,等.高效液相色谱法测定水果中的赤霉素、苯甲酸、糖精钠和胭脂红[J].中国卫生检测杂志,2008,18(7):1330-1332
[5]NurayErin,BernaAfacan,YaseminErsoy,etal.Gibberellicacid,a
plantgrowthregulator,increasesmastcellrecruitmentandaltersSubstancePlevels[J].Toxicology,2008(254):75-81
[6]
黄红林,刘实,张桃芝.固相萃取-高效液相色谱测定番茄中的赤霉素GA3残留[J].分析科学报,2005,21(1):75-77
[7]Kumar,PKRLonsane.BKMicrobialProductionofGibberellins:
StateofArt[J].Advancesinappliedmicrobiology，19(34):29-139[8]Barendse,GWMvandeWerken,PHN.High-performanceliquid
chromatograghyofgibberellins[J].Takahashi,Chromatogr,1980(198):449-476
[9]张元新.高效液相色谱检测赤霉素残留量的方法优化[D].长春:
东北师范大学,2008:10-15
[10]RuchiShukla,SubhshChand,AshokK.Srivastava.Batchkinetics
andmodelingofgibberellicacidproductionbyGibberellafujikuroi[J].Enzymeandmicrobialtechnology,2005(36):492-497
[11]唐根源,吴宏京.HPLC测定食用豆芽中激素物质的含量[J].色
谱,1993,11(5):321-323
[12]杨彤,丁兴萃.植物组织中赤霉酸高效液相色谱测定法的可靠
性探讨[J].竹子研究汇刊,1999,18(4):49-53
[13]GrolamysCastillo,ServandoMartinez.Reversed-phaseC18high-performanceliquidchromatograghyofgibberellinsGA3andGA1[J].JournalofChromatographyA,1997(782):137-139
[14]赵剑虹,孙成均.高效液相色谱法测定猪血清中的依维菌素[J].
四川大学学报:医学版,2005,36(1):37
[15]贝玉祥,杨阳.高效液相色谱法测定诃子中鞣花酸的含量[J].时
珍国医医药,2009,20(9):2178-2179
[16]田林锋,胡继伟,黄先飞,等.反相高效液相色谱法快速测定梨
中7种有机酸含量[J].食品研究与开发,2010,31(2):126-128
收稿日期：2010-06-18
