——２６８—— 肿瘤药学２０１２年８月第２卷第４期Ａｎｔｉ—ｔｕｍｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ａｕｇｕｓｔ ２０１２，Ｖｏ１．２，Ｎｏ．４ 紫花牡荆素对肝癌细胞凋亡的影响 及其机制研究★ 杨 军 ，杨小红 ，罗 琼。，钟志宏 ，何丽华 （ 中南大学湘雅三医院病理科，湖南长沙，４１００１３； 湖南师范大学医学院，湖南长沙，４１００１３） 摘要：目的研究紫花牡荆素（ｃａｓｔｉｃｉｎ）诱导肝癌细胞凋亡的作用及其分子机制。方法体外培养人肝癌ＰＬＣ／ Ｃａｓｔｉｃｉｎ ＰＲＦ／５和ＨｅＰ Ｇ２细胞系。通过碘化丙啶（ＰＩ）染色流式细胞术分析细胞凋亡率，ＥＬＩＳＡ法检测组蛋白／ＤＮＡ碎片的 含量，琼脂糖凝胶电泳观察ＤＮＡ断裂条带，Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测细胞内ＤＲ４和ＤＲ５蛋白表达水平。结果以浓度依赖方式增加ＰＬＣ／ＰＲＦ／５和ＨｅｐＧ２细胞系ｓｕｂ—Ｇ１细胞的百分率和组蛋白／ＤＮＡ片段的含量（Ｐ＜０．０５）， ｃａｓｔｉｃｉｎ（３０ ｐｍｏ１．Ｌ １作用细胞２４ ｈ后可出现ＤＮＡ梯度条带；ｃａｓｔｉｃｉｎ可以浓度依赖性方式诱导ＰＬＣ／ＰＲＦ／５内ＤＲ５ 蛋白水平的表达，但对ＤＲ４蛋白表达无影响；ＤＲ５／Ｆｃ嵌合蛋白预处理能有效降低ｃａｓｔｉｃｉｎ诱导的细胞凋亡。结论 Ｃａｓｔｉｃｉｎ可以浓度依赖性方式诱导肝癌细胞凋亡，其机制可能与上调细胞的ＤＲ５蛋白表达有关。 关键词：肝细胞癌；紫花牡荆素；死亡受体５；细胞凋亡 中图分类号：Ｒ７３５．７文献标识码：Ａ文章编号：２０９５—１２６４（２０１２）０４—０２６８—０５ ｄｏｉ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．２０９５—１２６４．２０１２．０４．００６ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｃａｓｔｉｃｉｎ ｏｎ Ａｐｐｏｔｏｓｉｓ ｏｆ Ｈｅｐａｔ０ｃｅｌｌｕＩａｒ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｉｔｓ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ★ Ｙａｎｇ Ｊｕｎ ，Ｙａｎｇ Ｘｉａｏｈｏｎｇ２，ｋｕｏ Ｑｉｏｎｇ２，Ｚｈｏｎｇ Ｚｈｉｈｏｎｇ２，Ｈｅ Ｌｉｈｕａ ｆ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＰａｔｈｏｌｏｇｙ，ｔｈｅ Ｔｈｉｒｄ Ｘｉａｎｇｙａ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｆ ｏＣｅｎｔｒａｌ Ｓｏｕｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ，Ｈｕｎａｎ，４１００１３ Ｃｈｉｎａ；。ＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，ＨｕｎａｎＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ，Ｈｕｎａｎ，４１００１３，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｃａｓｔｉｃｉｎ—ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ＰＬＣ／ＰＲＦ／５ ａｎｄ Ｈｅｐ Ｇ２ ｃｅｌｌ ｉｎｅｓｆ ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｒａｔｅ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｐｒｏｐｉｄ— ｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）ｓｔａｉｎｉｎｇ ｌｆｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ａｎｄ ｔｈｅ ｈｉｓｔｏｎｅ／ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｖｅｌ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ＥＬＩＳＡ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ．ＤＮＡ ｌｆａｇ— ｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ＤＲ４ ａｎｄ ＤＲ５ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｃａｓｔｉｃｉｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｈｅ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ ｓｕｂ—Ｇ１ ａｎｄ ｈｉｓｔｏｎｅ／ＤＮＡ ｒａｇｆｍｅｎｔ ｌｅｖｅｌ ｉｎ ＰＬＣ／ＰＲＦ／５ ａｎｄ Ｈｅｐ Ｇ２ ｃｅｌｌ ｈｎｅｓ ｉｎ ａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｉｔｏｎ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍａｎｎｅｒ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ３０ ｐｍｏｌ／Ｌ ｃａｓｔｉｃｉｎ ｆｏｒ ２４ ｈ ｒｅｓｌｔｕｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ．Ｃａｓｔｉｃｉｎ ａｌｓｏ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆＤＲ５ ｉｎ ＰＬＣ／ＰＲＦ／５ ｃｅｌｌ ｉｆｎｅ ｉｎ ａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍａｎｎｅｒ，ｂｕｔ ｉｔ ｈａｄ ｎｏ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＤＲ４．Ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ＤＲＳ／Ｆｃ ｃｈｉｍｅｒａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｃａｓｔｉｃｉｎ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｃａｓｔｉｃｉｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ＨＣＣ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍａｎｎｅｒ．Ｉｔｓ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｍａｙ ｂｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｔｓ ｒｏｌｅ ｉｎ ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆＤＲ５． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｌａｒ ｃａｒｃｉｕｎｏｍａ；Ｃａｓｔｉｃｉｎ；Ｄｅａｔｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ５；Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ 前言 高。大多数的患者在诊断为ＨＣＣ的一年内死亡， 患者５年的相对生存率仅为７ 。因此，寻找可 有效治疗肝癌的新药物具有十分重要的临床意义。 紫花牡荆素（ｃａｓｔｉｃｉｎ）是从蔓荆子即马鞭草科 植物蔓荆的果实中提取和纯化的一种有效成分，也 肝细胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｔａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＨＣＣ）是一 种常见的恶性肿瘤，目前其发病率居恶性肿瘤发病 率的第五位，是全球第三位的癌症死亡原因 ，即 使是在进行外科切除根治疗法后，其复发率仍极 基金项目：长沙市科技局科研项目资助（Ｋ１ １０４０６０—３１）；湖南省卫生厅科研项目资助（Ｂ２０１０—０３０） 作者简介：杨军，男，主管技师，研究方向：肿瘤病理学。Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｚｈ３１７０＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｒｎ．ｃｎ 通讯作者：何丽华，女，讲师，研究方向：肿瘤药物学。Ｅ－ｍａｉｌ：３５６６８０９５＠ｑｑ．ｃｏｎｒ 肿瘤药学２０１２年８月第２卷第４期Ａｎｔｉ—ｒｕｍ０ｒ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ａｕｇｕｓｔ ２０１２，Ｖｏ１．２，Ｎ０．４ ——２６９—— 是蔓荆子的主要活性成分。蔓荆子是一种传统中 药，也作为民间草药使用，被认为是一种抗炎剂 ， １．３组蛋白／ＤＮＡ碎片的ＥＬＩＳＡ检测用细胞凋 亡ＥＬＩＳＡ检测试剂盒检测经ｃａｓｔｉｅｉｎ处理后的细 且在中国四川等地用于治疗癌症 ，其化学结构 如图１所示。近年来，众多研究证明其对乳腺癌、 胞凋亡，根据厂商提供的说明书操作。主要步骤： 以１Ｘ１０ 个／孔的密度接种细胞于９６孑Ｌ板中，孵育 ２４ ｈ，然后加入含不同浓度ｃａｓｔｉｃｉｎ的培养基，２４ ｈ 宫颈癌＿６ ］、肺癌和胃癌Ｅ ８ ３具有抗癌活性。另外， 有文献报道Ｃａｓｔｉｅｉｎ可抑制人髓性白血病细胞生 长 ９］，并通过诱导细胞凋亡或有丝危象诱导 白血病细胞死亡＿ｌ。。。然而，ｃａｓｔｉｃｉｎ诱导ＨＣＣ细胞 后，将对照组及处理组的细胞裂解液转至预先包被 抗生物素链菌素的９６孔板中，并且该板事先在室 温下以生物素化的组蛋白抗体及过氧化物酶标记 凋亡的确切机制尚不清楚。因此，本研究拟观察 ｅａｓｔｉｅｉｎ诱导体外培养ＨＣＣ细胞凋亡的效应并初步 探讨其分子机制。 ｏＨ ＣＨ３０ ＯＨａＣ ＯＨ３Ｇ 图ｌ 紫花牡荆素的化学结构 Ｆｉｇ．１ Ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｓｔｉｃｉｎ １材料与方法 １．１ 细胞培养与试剂ＰＬＣ／ＰＲＦ／５（ｐ５３突变型）和 Ｈｅｐ Ｇ２（ｐ５３野生型）人肝癌细胞购自中国典型培养 物保藏中心ｆ中国武汉市），用添加１０％胎牛血清、 １００ Ｕ・ｍＬ一青霉素及１００／．ｔｇ・ｍＬ 链霉素的ＲＰＭＩ １６４０培养基，置３７℃，５％ＣＯ 的饱和湿度条件下 孵育。Ｃａｓｔｉｅｉｎ购自成都普瑞法科技开发有限公司 （中国成都），分子量为３７４－３，性状：黄色针形晶状固 体，纯度为９８．０％；以二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）为溶剂， 制备浓度为１０ ｒｎｍｏ１．Ｌ 的Ｃａｓｔｉｃｉｎ母液，使用前， 用培养基将母液稀释成标示的浓度。细胞凋亡酶联 免疫吸附法检测试剂盒（Ｒｏｃｈ，公司）；碘化丙啶（ＰＩ， Ｓｉｇｍａ公司）；溴化乙啶（ＥＢ，Ｓｉｇｍａ公司）；细胞凋亡 ＤＮＡ梯度检测试剂盒（Ｂｏｄａｔａｉｋｅ公司）；５一氟尿嘧啶 （５一ＦＵ，Ｓｉｇｍａ公司）；ＤＲ５／Ｆｃ嵌合蛋白（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ 公司）；鼠抗人ＤＲ５和ＤＲ４（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ公司）。 １．２ ＰＩ染色流式细胞术调整细胞密度为４×１０ 个．ｍＩ ～，将细胞接种于１００ ｍＬ培养瓶中，２４小时 之后，用含有不同浓度ｃａｓｔｉｃｉｎ或５一氟尿嘧啶的培 养基作用标示的时间。按照先前文献［１ｌｌ所述方法 进行碘化丙啶染色和ＤＮＡ含量分析。 的鼠抗人ＤＮＡ抗体孵育２ ｈ。用ＥＸＬ一８００型酶联 免疫吸附仪以４０５ ｎｍ测定吸光度。 １．４ Ｄ ＮＡ断裂条带检测 将细胞以４ Ｘ １ ０ 个・ｍＬ 的密度接种于１００ ｍＬ培养瓶中，２４小时 之后，以含不同浓度ｃａｓｔｉｃｉｎ的培养基孵育２４小 时。ＤＮＡ断裂条带检测实验按照先前文献＿ｌ ］所述 方法操作。 １．５蛋白印迹分析按照文献 描述的方法获得 细胞总提取物。将含有５０ ｇ蛋白质的细胞裂解 液用１０％ＳＤＳ一聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，随 后将印迹转移至聚偏氟乙烯（ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公 司，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）。以抗ＤＲ５，抗ＤＲ４及抗Ｂ—ａｃｔｉｎ 抗体为一抗。用ＥＣＬ化学发光试剂盒（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉ０ｔｅｃｈ，Ｐｉｓｅａｔａｗａｙ，ＮＪ）对信号进行检测。 用Ａｌｐｈａｚｍａｇｅｒ ２２００软件（Ｓｉｌｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｉｆｃ）进行图像 扫描和分析，ＤＲ５或ＤＲ４与Ｂ一肌动蛋白的相对谱 带强度比值代表其表达水平。 １．６统计学分析数据资料用ＳＰＳＳ １５．０软件包 （ＳＰＳＳ Ｉｎｃ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）建立数据库，并进行统计学 分析。数据表示为均数±标准差。经方差齐性检 验后，用单向方差分析对多组均值进行比较，用 ＬＳＤ法对均值进行两两比较。以Ｐ＜０．０５为差异具 有统计学意义的标准。 ’ ２结果 ２．１ Ｃａｓｔｉｃｉｎ对肝癌细胞凋亡率的影响 流式细 胞仪检测亚二倍体ＤＮＡ含量（ｓｕｂ—Ｇ１）细胞群的 结果如图２Ａ所示，ｃａｓｔｉｃｉｎ以浓度依赖方式诱导 ＰＬＣ／ＰＲＦ／５和ＨｅｐＧ２细胞中ｓｕｂ—Ｇ１细胞百分率 增加（Ｐ＜０．０５）。以１０／．ｔｍｏｌ・Ｌ ｃａｓｔｉｃｉｎ作用ＰＬＣ／ ＰＲＦ／５细胞２４小时，其作用强度明显高于５一氟 尿嘧啶（２６．８％±４．８％ ｓ １７．４％±５．１％）。在给予 ３０“ｍｏ１．Ｌ一 ｃａｓｔｉｃｉｎ作用１２小时后，ＰＬＣ／ＰＲＦ／５和 肿瘤药学２０１２年８月第２卷第４，／ＪｔＪ Ａｎｔｉ—ｔｕｒｎｎｒＰｈａ１￣ｎａｃｙ，ＡｕｇＬｌｓｔ ２０１２，Ｖｏ１．２，Ｎｏ．４ 细胞有丝，激活细胞凋亡通路，阻滞周期相关 蛋白等途径使肿瘤细胞阻滞在Ｇ２／Ｍ期，进而引起 细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用；通过抑制组胺的释放 而发挥抗炎作用；直接作用于脑垂体，使催乳素抑 制因子的分泌增多，从而降低血清催乳素水平，发 挥抗催乳素的作用；可通过清除体内的氧自由基而 发挥抗氧化作用ｌｌ 一 。由于Ｃａｓｔｉｃｉｎ存在于天然植 物及Ｅｌ常食物中，且对人体无毒无害，因而其药理 学活性Ｈ益受到国内外学者的关注，特别是其抗肿 瘤的活性已成为肿瘤治疗的研究热点之一。 早期手术切除仍然是目前肝癌最有效的治疗 方法，患者的预后主要取决于能否手术切除以及 治疗干预的程度。但是肝癌恶化程度高，发病隐 序的参 一４一 匿，早期诊断率低，７Ｏ％的患者就诊时已失去手术 切除的时机。因此，寻找治疗肝癌的非手术疗法 对提高肝癌患者的生存率和生存质量具有十分重 要的临床意义。本研究首先观察了Ｃａｓｔｉｃｉｎ对人肝 癌ＰＬＣ／ＰＲＦ／５和Ｈｅｐ Ｇ２细胞株的影响。结果显示 Ｃａｓｔｉｃｉｎ能以浓度和时间依赖性的方式诱导人肝癌 ＰＬＣ／ＰＲＦ／５和Ｈｅｐ Ｇ２细胞株发生凋亡。 死亡受体４（ｄｅａｔｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４ ＤＲ４）和死亡受体 ５（ｄｅａｔｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ５，ＤＲ５）均是肿瘤坏死因子相关凋 亡诱导配体（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｌａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ— ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ，ＴＲＡＩＬ）的受体，可向细胞内传递死 亡信号，诱导靶细胞凋亡。ＤＲ５广泛表达于多种 肿瘤细胞，但在正常组织细胞不表达或较少表达， 与ＴＲＡＩＬ的亲和力明显高于ＤＲ４，与之结合后可 选择性地杀伤肿瘤细胞，对机体正常组织无明显的 毒性¨ｌ 。因此，本实验研究了Ｃａｓｔｉｃｉｎ对肝癌细胞 ＤＲ４和ＤＲ５表达的影响，结果显示Ｃａｓｔｉｃｉｎ可以浓 度依赖性的方式增加人肝癌ＰＬＣ／ＰＲＦ／５细胞内ＤＲ５ 的表达，但对ＤＲ４的表达并无显著性影响，而用 ＤＲ５／Ｆｅ嵌合单克隆抗体预处理能有效降低Ｃａｓｔｉｅｉｎ 诱导的ＰＬＣ／ＰＲＦ／５和Ｈｅｐ Ｇ２细胞凋亡，提示ＤＲ５ 的上调参与了Ｃａｓｔｉｃｉｎ诱导肝癌细胞凋亡的过程。 总之，我们的研究表明，从蔓荆子中提取的多 甲氧基黄酮化合物即Ｃａｓｔｉｃｉｎ可有效地诱导肝癌细 胞凋亡，为肝癌的非手术治疗提供了新的线索，而 Ｃａｓｔｉｃｉｎ诱导肝癌细胞凋亡的作用与其上调ＤＲ５的 表达有关。ＤＲ５作为ＴＲＡＩＬ的受体，可作为肿瘤治 胡 州 ｍ ．儿． 他
