人小肠原发性恶性淋巴瘤裸小鼠高转移模型的建立

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人小肠原发性恶性淋巴瘤裸小鼠高转移模型的建立󰀁

200433󰀂上海󰀂第二军医大学研究生队󰀂脱󰀂帅󰀂刘秋珍 󰀂张󰀂宁 󰀂王明耀!

󰀂󰀂摘󰀂要󰀂目的󰀂为探讨小肠恶性淋巴瘤的发病机制和实验治疗提供理想的动物模型。方法󰀂将人小肠恶性淋巴瘤术中原发灶新鲜组织块和肝转移灶瘤组织分别移植于裸小鼠的小肠黏膜层内和肩胛间皮下,观察原位移植和皮下移植的成瘤率、移植瘤的侵袭和转移率。进行形态学(光镜、电镜和免疫组织化学)、染色体核型、流式细胞分析。结果󰀂5例人小肠恶性淋巴瘤标本中3例移植成功。依据WHO新的分类标准,从中筛选出1株同一人体瘤源人小肠原发性(非霍奇金B细胞性)恶性淋巴瘤裸鼠原位移植高转移模型(HSIL󰀁0101)和皮下移植高转移模型(HSIL󰀁0102)。移植瘤病理组织学为非霍奇金(大B细胞性)高度恶性淋巴瘤;免疫组化显示CD19、CD20、CD22、CD45阳性,CD3、CD7阴性。染色体众数55~59条;流式细胞示DI值1󰀂47~1󰀂49,均为异倍体。HSIL󰀁0101和HSIL󰀁0102分别传至32和38代;共移植裸鼠357只;肿瘤的移植生长率和液氮冻存复苏成活率均为100%。HSIL󰀁0101肝和淋巴结转移率为100%;HSIL󰀁0102肝转移率为63󰀂5%,淋巴结转移率为62󰀂7%。移植瘤在裸鼠的小肠内和皮下侵袭性生长,发生血行(肝、脾)转移、淋巴转移和腹腔内种植性转移。结论󰀂HSIL󰀁0101和HSIL󰀁0102是首次成功建立的人小肠恶性淋巴瘤裸鼠原位移植和皮下移植均出现自发性高转移的模型,可用于小肠恶性淋巴瘤的发病机制、侵袭、转移及实验治疗的研究。󰀂󰀂关键词󰀂肠肿瘤;淋巴瘤;肿瘤移植;肿瘤转移;疾病模型,动物󰀂󰀂中国图书资料分类号󰀂R735󰀂3+2

Reblicationofhighmetastasismodelofmalignantlymphomaofhumansmallintestineinnudemice

TuoShuai,LiuQiuzhen,ZhangNingetal.PastgraduateCollegeofSecondMilitaryUniversity,Shanghai200433,China

Abstract󰀂Objective󰀂Toreplicateanidealanimalmodelforexploringpathogenesisandexperimentaltreatmentofmalignantlymphomaofsmallintestine.Methods󰀂Freshlymphomatissuesderivedfromprimarylesionandlivermetastasisofmalignantlymphomaofhumansmallintestineob󰀁tainedduringoperationwererespectivelytransplantedintomucosaofsmallintestineandsubcutaneousspaceintheinterscapularregioninnudemice.Tumorigenicity,invasionandmetastasisoftransplantedtumorswereobserved.Morphology(lightmicroscopy,electronmicroscopyandimmunohisto󰀁chemistry),karyotypeanalysis,DNAquantitativeassay(FCM)werealsostudied.Results󰀂Fromfivepatientsofmalignantlymphomaofsmallintes󰀁tine,tumortissuefrom3patientswassuccessfullytransplanted.AccordingtothenewclassificationoftheWorldHealthOrganization,astrainofhighmetastaticmodeloforthotopicallytransplantedmalignantlymphomainnudemice(HSIL󰀁0101)andanotherofsubcutaneouslytransplantedhighlymetastaticmodelwerereproducedfromthesamehumanneoplasm(non󰀁HodgkinBcelltype);orthotopicallyPathologicalstudyshowedthatthetumorwashigh󰀁gradelargeB󰀁celllymphoma.HistochemitryshowedthatitwasCD19,CD20,CD22andCD45positive,andCD3andCD7negative.Thenumberofchromosomeisrangedfrom55to59;DI(DNAIndex)was1󰀂47~1󰀂61(ie,heteroploid).HSIL󰀁0101andHSIL󰀁0102hadbeenpassagedfor32and38generationsinnudemiceseparately.357nudemiceweretransplanted.Rateofgrowthofneoplasmtransplantationandresuscitationrateofliquidnitrogencryopreservationwereboth100%.InHSIL󰀁0101,metastasisrateofliverandlymphnodewas100%.InHSIL󰀁0102,metastasisrateofliverwas63󰀂5%andmetastasisrateoflymphnodewas62󰀂7%.Transplantedtumorsinvasivelygrewinsmallintestineandsubcutaneousre󰀁gionofnudemice.Bloodmetastasiswasfound(liverandspleenmetastases).Therewerealsolymphmetastasisandseedingmetastasisintheperitonealcavity.Conclusions󰀂Thestudyfirstsuccessfullyestablishedspontaneoushighmetastasismodelsofmalignantlymphomaofhumansmallintestineinnudemicebyorthotopicandsubcutaneoustransplantation.HSIL󰀁0101andHSIL󰀁0102couldbeusedtocarryouttheresearchonpathogenesis,inva󰀁sion,metastasis,andexperimentaltherapyofmalignantlymphomaofsmallintestine󰀂

󰀂󰀂Keywords󰀂intestinalneoplasms;lymphoma;neoplasmtransplantation;neoplasmmetastasis;diseasemodel,animal

󰀂󰀂小肠恶性淋巴瘤(malignantlymphomaofsmallintes󰀁tine)临床起病隐匿,症状和体征无特异性,术前诊断困难,预后很差。为深入探讨小肠恶性淋巴瘤的生物学行为,我院研究室在建立了胃恶性淋巴瘤裸鼠原位移植模

[1]

型的基础上,经过3年的努力又首次成功地建立起两株人小肠原发性恶性淋巴瘤裸鼠高转移模型,分别命名为HSIL󰀁0101和HSIL󰀁0102,这两株模型完整地重现了人小肠恶性淋巴瘤的自然临床病理过程,且转移模式与临床病人相似,为研究人小肠恶性淋巴瘤提供了理想的动物模型。现报道如下。1󰀂材料与方法

1󰀂1󰀂实验动物󰀂BALB/c󰀁nu/nu裸小鼠由中国医学科学

院肿瘤研究所肿瘤医院动物室提供,鼠龄3~5周,体重

17~20g,雌雄兼用,在SPF条件下的裸鼠室内饲养。1󰀂2󰀂标本来源与处理󰀂诊断明确的5例小肠原发性恶性淋巴瘤,术中新鲜组织标本由第202医院和辽宁省肿瘤医院提供。无菌切取的活体瘤组织置入RPMI10培养液中,清除非瘤组织,剪切成1mm3组织块,供移植用。

1󰀂3󰀂原位移植󰀂裸鼠用0󰀂5%戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射,全麻下取腹正中线切口,辨认空肠,在空肠的浆

脱󰀂帅,硕士生,医师。主要从事胃肠肿瘤的基础与临床研究。󰀁国家∀九五#重点医学科技攻关计划资助课题(编号96A230603)。 第202医院。!辽宁省肿瘤医院

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󰀂医学杂志2004年5月第29卷第5期MedJChinPLAMay2004Vol29No5󰀂

膜面向肠壁内做3mm切口深达黏膜层,以0/10无损伤缝合线经切口将2粒1mm3瘤块固定于肠壁黏膜层,0/7丝线缝合腹膜,0/5丝线缝皮。术后继续饲养,每周观察2次。当荷瘤裸鼠处于濒死状态时,取其中1只荷瘤裸鼠用颈椎脱位法处死,取出移植瘤,一部分瘤组织以原代移植方法行鼠间连续传代(每次5~10只不等),另一部分瘤组织液氮冻存备用进行相关指标检测。其他荷瘤裸鼠饲养至濒死状态或自然死亡,以观察其肿瘤的侵袭和转移情况。

1󰀂4󰀂皮下移植󰀂用2󰀂5%碘酊和75%酒精消毒裸鼠背部皮肤,用无菌套管针抽吸2粒1mm3肝转移灶组织块,行肩胛间皮下组织移植。当移植瘤生长至1cm左右时进行传代,每次接种5~6只。

1󰀂5󰀂解剖学和组织学检查󰀂全部处死和自然死亡荷瘤裸鼠均经详细解剖学检查,测量肿瘤体积,观察侵袭周围组织情况;观察腹腔肠系膜等区域淋巴结、肝和脾等各脏器有无肿瘤转移。移植瘤组织、区域淋巴结和各脏器组织标本经10%中性固定,石蜡切片,HE染色,光镜观察。

1󰀂6󰀂免疫组化染色󰀂采用LSAB法,对全部小肠和皮下肿瘤或有器官转移的切片应用CD3、CD7、CD19、CD20、CD22、CD45抗体进行染色,所用试剂均为Dako公司产品。1󰀂7󰀂电镜观察󰀂移植瘤以2󰀂5%戊二醛和1%锇酸双重固定,Epon󰀁812包埋,超薄切片,铀铅双重染色,PHILIPS󰀁CM10透射电镜观察。

1󰀂8󰀂流式细胞分析󰀂方法参照文献[2],采用美国FACS󰀁420型流式细胞仪对正常小肠黏膜细胞、瘤源标本和移植瘤细胞核进行DNA测定。

1󰀂9󰀂染色体检查󰀂采用短期培养,不加有丝刺激方

[3]

法,收获细胞,常规制片,GTG法染色,显微镜下观察。1󰀂10󰀂小肠恶性淋巴瘤分类标准󰀂采用WHO新的分类

[4]方法。

1󰀂11󰀂统计学处理󰀂所得数据以x%s表示,用SPSS10󰀂0软件进行数据处理,组间比较采用t检验。2󰀂结󰀂果

5例人小肠恶性淋巴瘤新鲜组织块原位移植裸小鼠后,其中3例(60%)移植获得成功。依据WHO新的淋巴瘤分类标准,从中选出1例,为37岁男性患者,手术证实空肠有多处浸润肥厚,并见数处穿孔,肠壁有0󰀂8cm&3cm圆形或不规则形斑块状浸润病灶,均较浆膜面隆起,灰白色切面,淋巴瘤细胞浸润黏膜、黏膜下层,肌层多被浸润破坏;整个肠壁增厚,灰白色;肠系膜淋巴结肿大,互相粘连;肝和脾脏见瘤结节。病理诊断:小肠原发性非霍奇金大B细胞性高度恶性淋巴瘤。将该例小肠原发性恶性淋巴瘤的裸鼠原位移植模型命名为HSIL󰀁0101模型,其皮下移植模型命名为HSIL󰀁0102模型。另2例液氮冻存。

2󰀂1󰀂HSIL󰀁0101与HSIL󰀁0102模型的建立󰀂HSIL󰀁0101模型取自人小肠恶性淋巴瘤原发灶新鲜组织,首代原位移植裸鼠7只,4只获移植成功。目前已传至32代,共移植裸鼠197只,潜伏期5󰀂4%1󰀂4天,传代间期为21󰀂0%1󰀂6天,从第3代起肿瘤的移植成瘤率、液氮冻存复苏成活率和自发转移率均为100%。大体观察发现,小肠壁有十余处浸润病灶,为圆形或不规则形,大小为0󰀂5mm&0󰀂3mm&0󰀂3mm,黏膜皱襞消失,表面有溃疡形成,切面肠壁明显增厚,尤其是黏膜及黏膜下层、肌层和浆膜层多被浸润破坏。肿瘤呈灰白色,有一段3~5cm肠管病变互相融合,肠管扩张,肿瘤穿透浆膜层,累及邻近区域淋巴结。经病理切片检查,197只发生肝转移和(或)淋巴结转移,只发生脾转移和(或)腹腔种植转移。

HSIL󰀁0102皮下移植模型来自于同一例瘤源的人小肠原发性恶性淋巴瘤肝转移灶新鲜组织块,用套管针首代皮下移植裸鼠5只,均获得移植成功。目前已传至38代,共移植裸鼠160只,潜伏期为6󰀂3%1󰀂2天,传代间期为25󰀂0%1󰀂6天,肿瘤移植成瘤率和液氮冻存复苏成活率均为100%。大体观察发现,移植瘤呈椭圆形,表面呈结节或颗粒状,与周围组织有不同程度粘连。瘤体被覆不完整结缔组织薄膜,毛细血管网丰富。瘤体大小为1󰀂5cm&1󰀂0cm,切面呈乳白色,无液化。经病理切片检查,102只出现肝转移,87只发生淋巴结转移。

2󰀂2󰀂HSIL󰀁0101模型和HSIL󰀁0102模型移植瘤生长侵袭和转移情况

2.2.1󰀂HSIL󰀁0101模型󰀂󰀁小肠内播散:在移植后第2周出现,可见淋巴瘤在裸小鼠的空肠、回肠和十二指肠呈侵袭性生长,小肠多处浸润肥厚,肠壁形成许多圆形或不规则形斑块状浸润病灶,该处黏膜皱襞消失,并见圆形或不规则形溃疡,有的可累及数厘米肠管形成环形病灶,肿瘤主要浸润黏膜、黏膜下层、肌层,组织大部分遭破坏,黏膜皱襞消失,并穿透浆膜,整个肠壁增厚,呈灰白色,表面可有溃疡形成,有的荷瘤裸鼠肿瘤广泛侵袭全小肠,肠管外观管壁僵硬,皮革状。 淋巴结转移:局限于腹腔、肠系膜、腹主动脉旁淋巴结,少数动物有肝门淋巴结转移。大体观察见转移淋巴结肿大,伴肿胀出血,镜检见瘤细胞侵入淋巴结实质,呈片块状,严重时几乎破坏淋巴结,发展成转移瘤结节。!肝转移:出现在原位移植第3周,多数动物局限在肝右叶,呈巨块形,少数动物肝左右叶均可见到多发性圆形或椭圆形大小不等瘤结节,转移灶小至血管内癌栓,大至肉眼可见到1󰀂0cm&0󰀂7cm&0󰀂5cm瘤块。镜下可见瘤细胞呈侵袭性生长,肝的右叶大部被瘤细胞破坏(图1)。∋脾转移:大体观察见脾肿大,与周围粘连,尤以肝为重,被膜完整,表面󰀂医学杂志2004年5月第29卷第5期MedJChinPLAMay2004Vol29No5󰀂

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呈结节状,结节间可融合,切面为大小不等的灰白色结节。镜下见肿瘤细胞弥漫侵袭性生长,脾窦被挤压而残缺,小梁和被膜被累及。(种植转移:可见腹腔、胃壁、肠系膜均有种植转移,有的转移灶大于原发灶,整个腹膜表面可被灰白色大小不等的转移瘤结节覆盖。

图3󰀂HSIL󰀁0101小肠移植瘤组织切片示大B细胞性恶性淋巴瘤(HE,&100)

Figure3󰀂IntestinetransplantationofbigBcelllymphoma

HSIL󰀁0101(HE,&100)

图1󰀂HSIL󰀁0101小肠内移植后23天,出现肝转移(HE,&100)

Figure1󰀂Livermetastasisappearedinthe23rddayafter

transplantationofHSIL󰀁0101tointestine(HE,&100)

2.2.2󰀂HSIL󰀁0102模型󰀂尽管皮下移植瘤外覆结缔组织包膜,但早期可见瘤细胞侵袭周围组织,逐步突破包膜侵入肌组织或转移至周围组织间隙、淋巴管和血管腔内,常突破腹壁肌层在腹腔内生长,可见肠系膜淋巴结、腹主动脉淋巴结转移,皮下瘤组织接种第5周出现肝转移(图2),并可见脾转移、腹膜种植转移。

图4󰀂HSIL󰀁0102皮下移植瘤组织切片示大B细胞

恶性淋巴瘤(HE,&100)

Figure4󰀂HypodermictransplantationofbigBcelllymphomaHSIL󰀁0102(HE,&100)

2󰀂4󰀂免疫组化检查󰀂HSIL󰀁0101模型和HSIL󰀁0102模

型的裸鼠移植瘤细胞和人源的小肠恶性淋巴瘤细胞,对CD19、CD20、CD22、CD45均呈阳性表达(图5、6),对CD3、CD7均呈阴性表达,结果完全一致。

2󰀂5󰀂瘤细胞DNA含量分析󰀂HSIL󰀁0101模型和HSIL󰀁0102模型的裸鼠移植瘤细胞和人源小肠恶性淋巴瘤细胞的FCM检测均示异倍体,结果见表1。3󰀂讨󰀂论

本研究采用人小肠恶性淋巴瘤(非霍奇金大B细胞

表1󰀂两株人小肠恶性淋巴瘤裸鼠移植瘤FCMDNA

检测结果(x%s)

组󰀂别

正常小肠黏膜细胞人小肠恶性淋巴瘤HSIL󰀁0101模型

DNA指数1󰀂00%0󰀂041󰀂59%0󰀂59(1)1󰀂49%0󰀂58

(1)

图2󰀂HSIL󰀁0102皮下接种后30天,肝内出现转移灶(HE,&100)

Figure2󰀂Metastasesinliverappearedinthe30thdayafter

hypodermicvaccinationofHSIL󰀁0102(HE,&100)

2󰀂3󰀂组织病理学检查󰀂光镜下瘤细胞弥漫分布,核大深染,核圆形、卵圆形或不规则形,核染色质不均匀,胞浆少,偶见核仁,可见核(图3、4)。电镜下瘤细胞核大,核椭圆形,有的核有1~2条不规则深沟及不对称分叶,形成多叶核,异染色质形成条块状沿核膜聚集,核仁大小不一,位于或靠近核膜,胞质少,可见少量肿胀线粒体及短小扩张的粗面内质网。

2󰀂6󰀂染色体核型分析󰀂HSIL󰀁0101模型和HSIL󰀁0102模型的移植瘤染色体众数为55~59条,介于二倍体和三倍体之间,均为非整倍体(异倍体)。

增殖指数15󰀂57%5󰀂6333󰀂42%5󰀂2333󰀂39%5󰀂88

倍体水平整倍体异倍体异倍体异倍体

HSIL󰀁0102模型1󰀂47%0󰀂47(1)33󰀂31%4󰀂39

󰀂󰀂注:与正常小肠黏膜细胞比较,(1)P<0󰀂01∃412∃

󰀂医学杂志2004年5月第29卷第5期MedJChinPLAMay2004Vol29No5󰀂

HSIL󰀁0102模型的肿瘤组织病理学、免疫组化表型、超微结构、DNA倍体水平和染色体核型的特点与人原肿瘤细胞一致,而且肿瘤的移植生长率和液氮冻存复苏成活率均为100%;HSIL󰀁0101模型的肝和淋巴结转移率均为100%;HSIL󰀁0102模型的肝转移率为63󰀂5%,淋巴结转移率为62󰀂7%。说明两模型的生物学特性是稳定的。值得提出的是,裸鼠移植瘤在宿主体内的生长和转移方式与临床上小肠恶性淋巴瘤患者的恶性经过相似。HSIL󰀁0102模型应用肝转移灶接种裸鼠皮下后即发生自

图5󰀂HSIL󰀁0101小肠移植瘤免疫组化染色CD19强阳性(&200)

Figure5󰀂CD19wasintensepositiveinintestinetransplantationofHSIL󰀁0101byimmunohistochemistry(&200)

发性肝转移,肝转移率之高(63󰀂5%)、转移程度之重、宿

主生存期之短均说明该瘤源标本恶性程度高,也证明转移灶移植是提高模型转移率的有效方法。本研究357只荷瘤裸鼠HSIL󰀁0101模型肝转移率为100%;HSIL󰀁0102模型肝转移率为63󰀂5%。而荷瘤裸鼠肠系膜淋巴结和腹主动脉旁淋巴结转移率为62󰀂7%。这些结果均表明,本研究所建立的2个人小肠恶性淋巴瘤裸鼠原位和皮下移植模型的病变过程,完整地表现出了AnnArbor分类法中人小肠恶性淋巴瘤病变的全部临床过程。

本研究建立的HSIL󰀁0101和HSIL󰀁0102模型具有肿瘤移植生长率和自发性转移率高的特点,我们考虑这是因为:󰀁肿瘤细胞本身具有高侵袭的恶性潜能,移植瘤组织均取材于小肠恶性淋巴瘤进展期标本,说明临床进展期标本是建立人转移瘤模型的重要基础; 与移植部位微环境有关,裸鼠小肠的微环境与人小肠相似,使植入的人肿瘤细胞出现类似于人小肠恶性淋巴瘤体内播散的过程,因此HSIL󰀁0101模型肝转移率显著高于HSIL󰀁0102模型。总之,这两个模型为小肠恶性淋巴瘤的发病机制、肿瘤侵袭和转移以及实验治疗的研究提供了一个理想的动物模型。

参考文献

12

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(2004󰀁02󰀁13收稿󰀂2004󰀁03󰀁13修回)

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图6󰀂HSIL󰀁0102皮下移植瘤免疫组化染色CD20强阳性(&200)

Figure6󰀂CD20wasintensepositiveinhypodermictransplantation

ofHSIL󰀁0102byimmunohistochemistry(&200)

恶性淋巴瘤)新鲜瘤组织,首次成功地建立了同一人源瘤

细胞的两个裸鼠移植瘤模型,即HSIL󰀁0101和HSIL󰀁0102,对深入研究小肠恶性淋巴瘤的生物学特性、组织发生、实验治疗和肿瘤免疫都具有非常重要的意义。在目前可供研究的人小肠恶性淋巴瘤组织标本不易获得的情况下,此模型的建成对系统开展小肠恶性淋巴瘤的手术、放疗、化疗实验治疗及基础理论研究提供了同一人体来源、可稳定传代、容易重复的良好的实验动物模型。

人小肠恶性淋巴瘤移植裸鼠后,能否始终保持原有的生物学特征是模型建成的关键。我们所建立的人小肠恶性淋巴瘤裸鼠原位和皮下移植模型,经过了长达3年的鼠间连续传代,是目前传代最长、生物学特性与人小肠原发性恶性淋巴瘤最相似的模型。HSIL󰀁0101和HSIL󰀁0102模型已分别传至32代和38代。Luzzi等[5]用实验性转移模型研究发现,进入血液循环中的瘤细胞真正能够存活者不到1%,形成转移灶者不到0󰀂01%,说明实验性模型转移率极低。而本研究建立的HSIL󰀁0101和

(本文编辑󰀂周国泰)