实验二 阳性克隆的筛选与鉴定、质粒DNA的提取（5学时）
一、实验目的：通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的技术和克隆载体的筛选与鉴定方法。
二、实验原理：
1、蓝白斑筛选原理
2、碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA之间在拓扑学上的差异而达到分离目的。
三、仪器、材料、试剂
(一)仪器：1、恒温摇床 2、台式离心机 3、高压灭菌锅 4、振荡器
(二)材料：1、 含PUC-18质粒的大肠杆菌 2、乙二胺四乙酸(EDTA)
3、三羟甲基氨基甲烷(Tris) 4.葡萄糖 5.氢氧化钠(NaOH) 6.十二烷基硫酸钠(SDS) 7、乙酸钾(KAc) 8、冰醋酸(HAc) 9、盐酸(HCl) 10、Tris饱和酚 11、氯仿 12、异戊醇 13、乙醇 14、胰RNA酶 15、羧苄青霉素
16、离心管
(三)试剂：1、溶液І (pH8.0) 2、溶液Ⅱ 3、溶液Ш 4、TE缓冲液(pH8.0)
5、0.5mol/LEDTA 6、氯仿:异戊醇(V:V=24:1) 7、Tris饱和酚:氯仿:异戊醇(V:V:V=25:24:1) 8、70%乙醇 9、胰RNA酶
四、实验步骤
1、先在3mL LB液体培养基中加入3uL羧苄青霉素(终浓度50ug/mL)，然后接入一个含puc-18质粒的大肠杆菌单菌落，37℃震荡培养过夜。
2、取过夜培养的菌液2mL加入离心管中，4000r/min离心1min，倒出培养液，将所有菌体细胞收集在离心管中。（每组至少做6管）
3、 加入100µl溶液І于含菌体细胞的离心管中，旋涡震荡将细菌沉淀悬浮，室温放置10min。
4、 加入200µl溶液Ⅱ(新鲜配置)，轻轻混匀内容物，溶液逐渐变清亮后加入溶液Ш(千万不可用旋涡震荡器，裂解时间不超过5min)。
5、 加入150µl溶液Ш(冰上预冷)，盖紧管口，轻轻混匀数次。冰上放置15min让质粒DNA复性(千万不可用旋涡震荡器)。
6、 12000r/min离心10min，将上清转至另一个离心管中。（注意用取，记着取多少）
7、 向上清中加入等体积饱和酚：氯仿：异戊醇溶液，旋涡混匀，12000r/min离心5min，将上清转至另一离心管中。
8、 向上清中加入等体积氯仿：异戊醇，旋涡混匀，12000r/min离心5min，将上清转移到另一个离心管中。
9、 向上清中加入2倍体积无水乙醇，旋涡混匀后，室温放置30min。12000r/min离心10min，吸去上清液。
10、用200µl 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀1次(12000r/min离心5min)，倒去上清液，空气中干燥。
11、加入20uLRTE，使质粒DNA完全溶解。
五、实验结果
有白色质粒沉淀，然后又溶解。
六、分析讨论
1、 溶液І、溶液Ⅱ、溶液Ш的作用分别是什么?
2、 为什么真核生物基因组DNA不能用碱裂解法提取?
3、 本实验需要掌握哪些知识和技术？
