一种CHO单克隆细胞株的筛选方法和应用[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 1079535 A(43)申请公布日 2018.04.27

(21)申请号 201611209263.9(22)申请日 2016.12.23

(71)申请人 浙江海隆生物科技有限公司

地址 312000 浙江省绍兴市滨海新城马欢

路398号科创中心2号楼5楼(72)发明人 钱泓　吴有强　卞广林　张强　

徐玉兰　车影　吴素芳　查银河　(74)专利代理机构 北京乾诚五洲知识产权代理

有限责任公司 11042

代理人 付晓青　李广文(51)Int.Cl.

C12N 5/10(2006.01)C12N 15/85(2006.01)C12N 15/65(2006.01)

(54)发明名称

一种CHO单克隆细胞株的筛选方法和应用(57)摘要

本发明公开了一种CHO单克隆细胞株的筛选方法和应用，该方法包括以下步骤：1)在pEE12.4载体上面插入一种抗生素筛选标记基因；2)将目的基因插入1)中改造的pEE12.4的多克隆位点中；3)将2)中构建的重组质粒转染CHO细胞；4)加压筛选得到阳性CHO细胞；5)从阳性细胞中筛选得到高表达目的蛋白的CHO单克隆细胞株。使用本发明的方法在CHO单克隆细胞株筛选时能够显著提高筛选效率，节约筛选时间；且在批量构建真核表达载体时能够显著提高工作效率和降低成本。

权利要求书1页 说明书8页 附图2页

CN 1079535 ACN 1079535 A

权　利　要　求　书

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1.一种CHO单克隆细胞株的筛选方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)在pEE12.4载体上面插入一种抗生素筛选标记基因，以得到改造的pEE12.4的多克隆位点；

2)将目的基因插入步骤1)中改造的pEE12.4的多克隆位点中，以获得构建的重组质粒；3)将步骤2)中构建的重组质粒通过转染试剂转染CHO细胞；4)加压筛选得到阳性CHO细胞；

5)从阳性CHO细胞中筛选得到高表达目的蛋白的CHO单克隆细胞株。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗生素筛选标记基因为嘌呤霉素乙酰转移酶基因、潮霉素磷酸转移酶基因、博来霉素耐药基因、氨基糖苷磷酸转移酶基因。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述抗生素筛选标记基因为嘌呤霉素乙酰转移酶基因。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述pEE12.4的多克隆位点与抗生素筛选标记基因之间还有IRES序列。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CHO细胞为CHO-K1细胞。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组质粒转染CHO细胞时使用的转染试剂为lipofectamine 2000、lipofectamine 3000、Lipofectamine LTX。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的重组质粒转染CHO细胞时使用的转染试剂为Lipofectamine LTX，所述Lipofectamine LTX与重组质粒的质量比为9:2.5。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)和步骤5)的筛选是在培养基中加入5μg/ml puromycin和25μM MSX。

9.一种根据权利要求1-4任一权利要求所述的方法在构建真核表达载体中的应用。10.一种根据权利要求1-8任一权利要求所述的方法在CHO单克隆细胞株筛选中的应用。

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一种CHO单克隆细胞株的筛选方法和应用

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技术领域[0001]本发明涉及CHO单克隆细胞株的筛选方法和应用，属于细胞工程领域。

背景技术[0002]CHO细胞是1957年美国科罗拉多大学Theodore T.Puck博士从成年雌性仓鼠卵巢中分离获得的，为上皮贴壁型细胞。该细胞具有不死性，可以传代百代以上，是目前生物工程上广泛使用的细胞。相对于其他的表达系统，它有如下优势：(1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白；(2)既可贴壁生长，又可悬浮培养，且耐受较高的剪切力和渗透压；(3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，且外源蛋白的整合稳定；(4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物的分离纯化；(5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养，且培养体积能达到1,000L以上，可大规模生产。[0003]CHO细胞类型比较多，如：DG44、DXB11、CHO K1和CHO-S等。自20世纪80-90年代开始，工业上较早使用的是DHFR(二氢叶酸还原酶缺陷型)基因扩增筛选系统，其宿主细胞株为DG44。当细胞培养基内含有甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)时，二氢叶酸还原酶被抑制，通过反馈调节，使得该基因进行扩增，其上下游100-1,000kb范围内的基因都会随之扩增，因此将目的基因插入此位点范围内即可得到扩增。现在很多单抗生产的体系依然是DG44的DHFR体系。GS(谷氨酰胺合成酶)扩增系统，以CHO-K1为宿主细胞，是近些年发展的一种新型基因扩增筛选系统，较DHFR系统有明显的优越性，目前在国际上得到了广泛的认可和使用。其原理是GS在ATP水解提供能量的同时，利用细胞内的氨和谷氨酸合成谷氨酰胺。在缺乏外源谷氨酰胺的培养基中加入GS抑制剂甲硫氨酸亚砜亚铵(L-methioninesulfoximine，MSX)，可使GS基因及与之相连的目的基因得到有效扩增，从而达到提高目的基因表达水平的目的。该系统的优点主要在：(1)不需要基因缺陷型的CHO-K1细胞株作为宿主细胞；(2)CHO-K1细胞易于培养且更强壮；(3)在培养基中无需加入谷氨酰胺，能够避免谷氨酰胺分解造成培养体系中氨水平高的问题，降低了工艺控制的难度，并且能有效提高细胞发酵密度和延长细胞生存时间。[0004]pEE系列载体是Lonza生物公司研发的Glutamine Synthetase(GS,谷氨酰胺合成酶)基因表达系统，利用谷氨酰胺合成酶筛选标记，能够高水平的在哺乳细胞内表达目的基因，最常用的有pEE6.4和pEE12.4表达载体。本实验室将目的基因(如GFP亚克隆序列)插入pEE12.4载体后转染CHO-K1细胞，在单克隆细胞株筛选时发现假阳性很高，筛选效率仅能达到40％-50％。[0005]Lipofectamine系列试剂是Thermo Fisher公司研发的脂质体转染试剂，该系列转染试剂在类型广泛的细胞种类中具有优异的效率、活力和重现性，迄今已被引证超过50,000次。最常用的有Lipofectamine 2000、Lipofectamine 3000、Lipofectamine LTX等。发明内容

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本发明要解决的技术问题是CHO单克隆细胞株筛选时使用pEE12.4载体自带的筛

选标记(即GS筛选)筛选效率低且假阳性高。[0007]本发明提供了一种CHO单克隆细胞株的筛选方法，该方法包括以下步骤：1)在pEE12.4载体上面插入一种抗生素筛选标记基因，以得到改造的pEE12.4的多克隆位点；2)将目的基因插入步骤1)中改造的pEE12.4的多克隆位点中，以获得构建的重组质粒；3)将步骤2)中构建的重组质粒通过转染试剂转染CHO细胞；4)加压筛选得到阳性CHO细胞；5)从阳性CHO细胞中筛选得到高表达目的蛋白的CHO单克隆细胞株。[0008]本发明的技术方案中，所述抗生素筛选标记基因为嘌呤霉素乙酰转移酶基因、潮霉素磷酸转移酶基因、博来霉素耐药基因、氨基糖苷磷酸转移酶基因；优选的抗生素筛选标记基因为嘌呤霉素乙酰转移酶基因。[0009]本发明的技术方案中，优先pEE12.4的多克隆位点与抗生素筛选标记基因之间还有IRES序列。[0010]本发明的技术方案中，优先的CHO细胞为CHO-K1细胞。[0011]本发明的技术方案中，所述重组质粒转染CHO细胞时使用的转染试剂为lipofectamine 2000、lipofectamine 3000、Lipofectamine LTX；优选的是Lipofectamine LTX，；优选的Lipofectamine LTX与重组质粒的质量比为9:2.5。[0012]本发明的技术方案中，优选的单克隆细胞株筛选时是在培养基中加入5μg/ml puromycin和25μM MSX。[0013]本发明还提供了一种构建真核表达载体的方法及其应用。在本发明的一个优选实施例中，在本发明的改造的pEE12.4-IRES-puro质粒中插入GFP基因或者猪瘟E2基因，得到pEE12.4-GFP-IRES-puro重组质粒和pEE12.4-E2-IRES-puro重组质粒。该构建过程简单、易重复，且无需从pEE12.4质粒开始逐步构建得到pEE12.4-GFP-IRES-puro重组质粒或pEE12.4-E2-IRES-puro重组质粒。因此，在批量构建真核表达载体时能够显著提高工作效率和降低成本。[0014]使用本发明的方法在筛选CHO单克隆细胞株时能够显著提高筛选效率，节约筛选时间，筛选效率能高达70％-80％，远高于仅使用GS筛选系统的40％-50％。附图说明[0015]图1 pEE12.4-IRES-puro质粒图谱。[0016]图2 IRES-puro PCR结果电泳图。M：DL5,000；1：IRES-puro(E1)，约1,219bp。[0017]图3 pEE12.4-IRES-puro质粒酶切验证结果电泳图。M：DL10,000；1-5：pEE12.4-IRES-puro-1-5(EcoR I酶切，载体大小约8788bp)，酶切正确；6-10：pEE12.4-IRES-puro-12，14，18，20，22(EcoR I酶切，载体大小约8788bp)，酶切正确；11：EcoR I单酶切阴性对照。[0018]图4三种转染试剂转染pEE12.4-GFP-IRES-puro重组质粒的荧光检测结果。4a表示lipofectamine 2000转染结果；4b表示lipofectamine 3000转染结果；4c表示Lipofectamine LTX转染结果。具体实施方式[0019]以下将结合附图和实施例对本发明做进一步说明，本发明的实施例仅用于说明本

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发明的技术方案，并非限定本发明。[0020]本发明实施例中所使用的菌株、质粒和试剂等均为市售产品。[0021]真核表达载体PEE12.4购自上海林渊生物科技有限公司。[0022]嘌呤霉素乙酰转移酶由北京大学医学部天然药物与仿生药物国家重点实验室周德敏教授惠赠。[0023]潮霉素磷酸转移酶基因(GenBank:X03615)交由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，合成所得的工程菌标记为DH5α-pUC57-hpt，博来霉素耐药基因来源于pcDNA3.1/Zeo(+)(Invtrogen)、氨基糖苷磷酸转移酶基因来源于pcDNA3.1(Invtrogen)。[0024]IRES序列由北京大学医学部天然药物与仿生药物国家重点实验室周德敏教授惠赠。[0025]CHO-K1细胞来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库中国科学院上海生命科学研究所细胞库。[0026]lipofectamine 2000、lipofectamine 3000、Lipofectamine LTX从Thermo Fisher购买。[0027]以下以嘌呤霉素乙酰转移酶基因(PURO)为例说明本发明的具体实施方法。[0028]实施例1：PCR扩增目的片段IRES-PURO[0029]1.1PCR反应[0030](1)引物设计和合成[0031]上游引物:5’-GGGCACGTGCGGACCGAATTGAATTCAATTCCGCCCCTCTCC-3’[0032]下游引物:5’-CTGATTATGATCAATGAATTTCAGGCACCGGGCTTGCGGGTCATGCAC-3’[0033](2)加样体系25μL，如下表所示：

[0034]

[0035]

PCR扩增程序：

[0036]

[0037][0038]

1.2 PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳

(1)根据PCR产物片段大小配制一定浓度的琼脂糖凝胶。

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0.8％琼脂糖凝胶：称取0.8g琼脂糖放入250mL蓝色试剂瓶中，并向其中加入100mL 

1×TAE溶液，将其放入微波炉加热2min左右使其溶解。[0040](2)准备制胶板，插入小孔样品梳，调节制胶板保持水平状态。[0041](3)待琼脂糖凝胶溶液冷却至40-50℃，向琼脂糖凝胶溶液中加入10μL 10mg/mL溴化乙锭溶液，混匀。[0042](4)将琼脂糖凝胶溶液倒入制胶板中，待琼脂糖凝胶凝固后，将琼脂糖胶放入电泳槽中，轻轻拔出样品梳。[0043](5)取5μL PCR产物与0.5μL 10×loading buffer混匀后加入到琼脂糖凝胶加样孔中，取5μL DNA分子量标准试剂作为分析DNA片段大小的标准。[0044](6)确认电极方向正确，盖上电泳槽盖子，调整电泳仪电压至95V，恒压，电泳15-20min，关闭电泳仪。[0045](7)成像仪显像，分析结果并保存图片。具体结果如图2所示。[0046]1.3 PCR产物进行胶回收[0047](1)标记好样品收集EP管、吸附柱以及收集管。[0048](2)称取标记好的空的EP管重量，并记录数值。[0049](3)将单一的目的DNA条带在切胶仪上从琼脂糖凝胶中用手术刀小心切下放入干净的1.5mL离心管中。[0050](4)向步骤(3)中的1.5mL离心管中加入600μL PC buffer50℃水浴放置5min左右，其间不断温和上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。[0051](5)柱平衡：向吸附柱CB2中(吸附柱预先放入收集管中)加入500μL平衡液BL，离心12,000rpm，1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。[0052](6)将步骤(5)所得溶液加至吸附柱CB2中，静置2min，10,000rpm，离心30s，倒掉收集管中的废液，再将吸附柱CB2放入收集管中。[0053](7)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW buffer，静置3min，离心10,000rpm，30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。[0054](8)重复步骤(7)。[0055](9)空吸附柱离心，12,000rpm，2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置10min，彻底晾干。[0056](10)将吸附柱CB2放入收集管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μL Elution buffer(65℃预热)，静置3min，离心12,000rpm，2min。[0057](11)从离心机中取出步骤(10)中离心管，丢弃中间的吸附柱CB2，盖上离心管盖子，保留离心管中的DNA样品。[0058](12)将步骤11中的DNA样品置于4℃保存，准备琼脂糖凝胶电泳鉴定胶回收DNA片段。[0059]实施例2：载体单酶切反应[0060]2.1酶切反应[0061](1)标记好需要用到的1.5mL EP管，在1.5mL EP管中按照下表进行加样、混匀：反应体系为50μL，加样如下表所示：

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[0062]

[0063][00][0065][0066][0067][0068]

(2)将步骤(1)中的1.5mL EP管置于37℃恒温水浴锅中，水浴2-3h。2.2双酶切产物胶回收取出上述双酶切体系，进行琼脂糖凝胶电泳以回收其中的DNA片段，方法同1.3。实施例3：连接反应

(1)标记需要用到的0.2mL离心管。

(2)在标记完整的0.2mL管中按照下表的20μL反应体系进行加样：

[0069]

(3)完成加样后，用移液器轻轻吹打几次混匀各组分。

[0071](4)将0.2mL离心管置于37℃反应30min，待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min。[0072](5)步骤(4)的反应产物可直接进行转化实验，也可储存于-20℃，待需要时解冻转化。[0073]实施例4：转化反应[0074](1)将10μL连接反应液快速加入100μL感受态细胞中，并吹打混匀，冰浴30min。[0075](2)步骤(1)完成后，取出样品管，置于42℃水浴100s，然后立即冰浴2min。[0076](3)步骤(2)完成后，取出样品管，在超净工作台中，向样品管中加入600μL液体LB培养基，然后将样品管置于37℃恒温摇床，220rpm，培养1h。[0077](4)制备转化平板，依据质粒抗性制备转化用LB抗性平板。[0078](5)涂板：取出步骤(3)中样品管，室温离心8,000rpm，2min，去掉600μL上清液体，剩余上清液重悬管底部的菌体，将重悬的菌液放入相应的转化平板中心，用涂菌棒将转化平板中心的菌液均匀铺开。[0079](6)将步骤(5)平板正置于生化恒温培养箱中，37℃培养1h后，将转化平板倒置进行培养15h。[0080](7)观察记录转化结果。[0081]实施例5：质粒抽提与双酶切鉴定[0082]5.1质粒抽提

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(1)用10μL移液头从转化平板中挑取单克隆至5ml含氨苄抗性的LB液体培养基

中，37℃，220rpm摇菌过夜。[0084](2)吸取菌液至1.5mL EP管中，室温离心，12,000rpm，2min，弃上清。[0085](3)向步骤(2)中的EP管中加入250μL质粒提取试剂P1buffer，彻底悬浮菌体。[0086](4)向步骤(3)溶液中加入250μL P2buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀。室温静置2-4min。[0087](5)向步骤(4)溶液中加入350μL P3buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀。室温静置2-4min。[0088](6)将步骤(5)溶液，室温离心，14,000rpm，10min。[00](7)将步骤(6)中上清溶液移至吸附柱中心，室温离心，12,000rpm，30s，倒掉收集管中液体。[0090](8)向吸附柱中心加入500μL Buffer DW1，室温离心，12,000rpm，30s，倒掉收集管中液体。[0091](9)向吸附柱中心加入500μL wash solution，室温离心，12,000rpm，30s，倒掉收集管中液体。重复一次。[0092](10)空吸附柱，室温离心，12,000rpm，2min。[0093](11)将吸附柱放入一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜中心加入30μL Elution buffer，室温静置5min，室温离心，12,000rpm，2min，4℃保存管中DNA溶液。[0094]5.2酶切鉴定[0095](1)标记好需要用到的1.5mL EP管，按照下表进行加样、混匀，反应体系为20μL：

[0096]

(2)将加样完成的步骤(1)中的1.5mL EP管置于37℃恒温水浴锅中，水浴2h。[0098](3)将步骤(2)中的样品进行琼脂糖凝胶电泳，检查插入片段大小是否正确。结果如图3所示。[0099](4)选择插入片段正确的克隆送测序公司测序。[0100]实施例6：pEE12.4-GFP-IRES-puro和pEE12.4-E2-IRES-puro的构建[0101]6.1目的基因片段的扩增[0102]以重组质粒pEGFP-N1或合成的猪瘟E2蛋白核苷酸序列为模板，分别设计合适的引物，通过PCR扩增出GFP或E2亚克隆片段(两端分别含有HindIII和EcoRI酶切位点)。具体操作见实施例1。[0103]6.2双酶切反应[0104]通过Hind-III和EcoRI-HF双酶切pEE12.4-IRES-puro载体及GFP片段或E2片段，切胶回收。具体操作见实施例5。

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6.3连接反应

[0106]将PCR克隆得到的GFP片段或E2片段和重组质粒pEE12.4-IRES-puro进行连接反应。具体操作见实施例3。[0107]实施例7：CHO-K1细胞转染[0108](1)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；DMEM/F12(含10％血清，1％双抗)、DMEM/F12与PBS置于37℃水浴锅预热至37℃。[0109](2)从37℃培养箱中取出细胞(10cm细胞培养皿)，弃去上清培养基，用预温的8ml PBS洗细胞一次，并弃去PBS。[0110](3)每个10cm细胞培养皿加入1-2ml 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，显微镜下观察细胞皱缩变圆，并呈单个细胞。[0111](4)加入4ml DMEM/F12(含10％血清，1％双抗)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。[0112](5)将消化好的细胞转移至15ml离心管中，常温离心，200g，5min。[0113](6)用DMEM/F12(含10％血清，1％双抗)重新悬浮细胞，计数。[0114](7)稀释细胞至2×105个/ml，取2ml混匀的细胞加入到六孔板，六孔板放置到37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育过夜。[0115](8)取出步骤(7)细胞培养皿，观察细胞状态：当细胞交汇度达到80％-90％时即可开始转染，转染前将培养基换成无抗生素无血清的DMEM/F12，2mL/孔。[0116](9)稀释质粒：用OPTI-MEM稀释质粒，125μl OPTI-MEM中加入2.5μg pEE12.4-GFP-IRES-puro重组质粒或pEE12.4-E2-IRES-puro，然后加入2.5μl plus，混匀，室温静置5min。[0117](10)按照说明书稀释lipofectamine 2000或lipofectamine 3000或Lipofectamine LTX，例如125μl OPTI-MEM中加入9μl Lipofectamine LTX，然后加入2.5μl plus，轻轻混匀，室温静置5min。[0118](11)将步骤(9)和步骤(10)混合物轻轻混匀。室温放置5min，然后逐滴加入六孔板中均匀分布。[0119](12)将六孔板置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养4-6h。[0120](13)换液：弃掉上清培养基，加入2ml DMEM/F12(含10％血清1％双抗)，将六孔板置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养过夜。转染24h用荧光显微镜拍照，结果如图4所示，Lipofectamine LTX转染效率最高。[0121]实施例8：加压筛选(分别筛选含实施例7转染的两种质粒的细胞)[0122]使用Lipofectamine LTX转染后24h开始加压：从37℃培养箱中取出六孔板细胞，弃去上清培养基，加入2ml DMEM/F12(含10％血清+5μg/ml puromycin+25μM MSX)，加压7d，中间观察细胞，死细胞多换液。[0123]实施例9：单克隆筛选(分别筛选含实施例7转染的两种质粒的单克隆细胞株)[0124](1)加压筛选至阴性对照细胞基本死光时，约7days，开始单克隆筛选。[0125](2)取出六孔板，弃掉培养基，PBS洗一次，然后加入300μl 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，加入2ml DMEM/F12(含10％血清+5μg/ml puromycin+25μM MSX)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。[0126](3)将消化好的细胞转移至15ml离心管中，常温离心，200g，5min。

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(4)用DMEM/F12(含10％血清+5μg/ml puromycin+25μM MSX)重新悬浮细胞，计数。

[0128](5)铺板：稀释细胞至5个/ml，取200μL混匀的细胞加入到96孔板中，放置到37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育4-6h。[0129](6)记录单个细胞的孔。[0130](7)待96孔板中单个细胞的孔长起来时，弃掉培养基，PBS洗一次，加入100μl 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，加入2ml DMEM/F12(含10％血清+5μg/ml puromycin+25μM MSX)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。将细胞液转移至12孔板，待12孔板长满时，取上清，ELISA检测克隆是否为阳性，高表达的阳性克隆继续扩大培养、冻存。[0131](8)经过计算，使用该系统的在单克隆细胞株筛选时，分别表达两种蛋白(GFP或E2)的单克隆细胞株的筛选效率均能达到70％-80％。[0132]实施例10：pEE12.4载体上面插入其他抗生素筛选标记基因及CHO单克隆细胞株的筛选[0133]10.1重组质粒构建[0134](1)按照实施例1至实施例5的方法，在pEE12.4载体上面构建其他抗生素筛选标记基因，如潮霉素磷酸转移酶基因、博来霉素耐药基因、氨基糖苷磷酸转移酶基因等。[0135](2)按照实施例6的方法，在构建好的重组质粒中加入目的基因，如实施例6中加入的GFP基因和猪瘟E2基因。[0136]10.2 CHO单克隆细胞株筛选[0137](1)按照实施例7至实施例9的方法，筛选高表达目的蛋白CHO单克隆细胞株，在筛选时，仅在加入的抗生素筛选试剂略有差异，具体加入的抗生素筛选试剂如下表所示：

[0138]

(2)经过计算，使用不同的抗生素筛选标记基因的在单克隆细胞株筛选时，筛选效率基本一致，均能达到70％-80％。[0140]本发明通过上面的实施例进行举例说明，但是，应当理解，本发明并不限于这里所描述的特殊实例和实施方案。在这里包含这些特殊实例和实施方案的目的在于帮助本领域中的技术人员实践本发明。任何本领域中的技术人员很容易在不脱离本发明精神和范围的情况下进行进一步的改进和完善，因此本发明只受到本发明权利要求的内容和范围的，其意图涵盖所有包括在由附录权利要求所限定的本发明精神和范围内的备选方案和等同方案。

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说　明　书　附　图

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说　明　书　附　图

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