济源市疾病预防控制中心 文件编号： 第 1 页 共1页 起草人：王军鹏 批准人： 第 1版 第 1次修订 审核人： 批准日期：2013年12月18日 作业指导书 标题：MDCK细胞复苏标准操作规程 1. 范围
实施日期：2013年12月18日 适用于实验室所有技术人员进行MDCK细胞的复苏操作。
2. MDCK细胞复苏程序 2.1 生物安全要求
MDCK细胞复苏实验室生物安全级别：BSL-2 ，所有操作必须在BSL-2实验室的生物安全柜里进行。 2.2 材料
2.2.1 37℃恒温水浴箱； 2.2.2 细胞生长液； 2.2.3 胎牛血清1mL；
2.2.4 T-25培养瓶，无菌移液管; 2.2.5 70％～75％的酒精; 2.2.6 15mL无菌离心管;
注意事项：经常检查试剂使用的有效期和MDCK细胞的代数。 2.3 实验步骤
2.3.1 将细胞生长液放入37℃水浴预热，预热后以70％～75％的酒精擦拭外壁，放入生物
安全柜内.
2.3.2 自液氮中取出细胞冻存管，检查盖子是否旋紧，避免热胀冷缩过程盖子松掉。 2.3.3 立即放入37℃水浴中快速解冻，轻轻摇动使其在1min内全部融化，以70％～75％的
酒精擦拭保存管外部，移入生物安全柜内；在解冻过程中，需做好个人防护，防止冻存管爆裂。
2.3.4 取出1.0mL解冻的细胞悬液，缓慢加入到预先加有5mL细胞生长液的15mL离心管内，
1000rpm，离心5min，弃去上清，用5mL细胞生长液重悬细胞，移入细胞培养瓶内，放入37℃ 5%CO2培养箱培养。
注意事项：复苏细胞的原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶对细胞造成损害，从而导致细
胞死亡。新复苏的细胞一般需要数日或继续传代1~2代，其细胞生长或细胞特性才会恢复正常。
3．说明
3.1整个试验过程要防止MDCK细胞污染。 3.2保持MDCK细胞的敏感性。
4.技术依据
WS285-2008《流行性感冒诊断标准》附录A、B。
