新型催化剂

摘要：对新型生物催化剂核酶和脱氧核酶的研究及发展进行简要的概述。

关键字：生物催化剂 核酶 脱氧核酶 RNA DNA

New biological catalysthen--ribozyme and deoxyribozyme

Abstract:Study on a new biological catalyst enzyme and DNA enzyme and a brief overview of the development.

Key words :biological catalyst ribozyme deoxyribozyme

生物催化即酶催化的反应通常被认为是在稀释的、经过缓冲处理过的体液介质，在普通室温和大气压力条件下进行的。现在看来,这个概念似乎已经过时。酶反应实际上能够在不同于上述温和条件的逆性环境（有机溶剂、高低温、压力、氧化剂、卤化物、高盐浓度、偏酸偏碱的pH、表面活性剂等）中实现。近年来,科学家们还运用化学及遗传修饰技术来构建合成酶，使生物催化剂酶具有愈来愈高的扰逆特性,以适应工业、农业、医学和环境等领域的需要[1]。 一、核酶(ribozym e)

1982年美国科罗拉多大学的T.R.Cech等人发现四膜虫rRNA前体在鸟苷存在，但完全无蛋白质的情况下能进行自我拼接，后来于1986年又发现L19RNA在一定条件下能够以高度专一性的方式去催化寡聚核糖核苷酸底物切割与拼接。1983年S.Altm an和N.Pace发现核糖核酸酶P(RN aseP,由20%蛋白质和80% RNA组成)可催化大肠杆菌tRNA前体在5′端切去1个寡核苷酸片段转变为成熟的tRNA,而其中有酶的催化活性的是RN ase P的RNA 组分。由于T. R.Cech和S. A ltm an各自发现了RNA的催化活性，因而共同获得19年的诺贝尔化学奖，他们定义这类具有催化活性的核糖核酸为ribozym e,通常译为核酶。此后又陆续发现了其它的RNA催化剂(如：大肠杆菌23S rRNA的特定区域对肽键形成有催化作用，具肽酰转移酶活性)，并人工制造出许多RNA催化剂。它们的作用底物除了RNA外，还有DNA、多糖及氨基酸酯等。近年来，人们已利用核酶定点切割

RNA分子的特性，开始设计核酶进行抗病毒、抗肿瘤和针对某些遗传疾病的核酶治疗研究，展示了核酶应用的广阔前景。 （一）酶性RNA

从1833年Payen和Persoz发现第一个酶起，直到20世纪80年代初期，发现的酶已逾4000种,这些酶都是生物体自然产生的具有催化能力的蛋白质。因此，长期以来人们认为只有某些蛋白质才具有生物催化功能。然而，人类对任何事物的认识都会经历一个逐步发展的过程。20世纪60～70年代，一些著名的哲人生物学家就曾推测生命发展的早期，核酸也可能具有类似酶的活性，如Woese[8,9]，Crick ,Orgel[9,10],Miller,Klug[8]。80年代初,Cech和Altman等人的杰出工作证实了上述猜测：1981年Cech等发现原生动物四膜虫26SrRNA前体具有自我剪切功能[8],并于1986年证明其内含子L219ⅣS具有多种催化功能；1983年Alt2man等发现大肠杆菌 RNaseP 的核酸组分M1RNA 具有该酶活性 ,而该酶的蛋白质部分C5 蛋白并无酶活性[9]。他们二人因此共同荣获了19年的诺贝尔奖。具有酶活性的RNA被称为ribozyme.随着自然界更多功能的 ribozyme的揭示发现ribozyme一般具有保守的锤头结构(hammer2head structure)[11]。一些实验室利用这一特性设计并合成出一系列新的ri2bozyme [12~14]，而结合运用体外选择(in vitro selection)技术[15,16]获得了更多不同功能的高效ribozyme ,“RNA 世界”(RNA world)的概念也随即被提出[17]。现在可以把所有的 ribozyme 分成3类:自我剪接ribozyme、自我剪切ribozyme以及催化分子间反应的ribozyme.Ribozyme的底物也由RNA扩大到DNA、糖类、氨基酸酯。这些事实表明了ribozyme的普遍性。Ribozyme的催化活性依赖于RNA的结构,具有很高的底物专一性,这与酶的催化行为极其相似。迄今所发现的天然ribozyme可催化3种反应 ,而人工合成的ribozyme可催化12种反应[18]。 （二）酶性 DNA

沿着Cech、Altman开拓的思路,生物化学家们设计了含有DNA的 ribozyme,即以不同数目的脱氧核糖核苷酸取代 ribozyme保守序列中的核糖核苷酸。尽管这种取代会导致酶活性的降低[19] ,但也另有实验表明ribozyme中核糖磷酸骨架并非严格必要[20],这为DNA也具有酶活性的研究提供了思考的线索,所以这方面的工作具有启发意义。Dervan[21]设计了一些DNA结合分子(DNA binding Molecule,

即在DNA一端接上一个小分子),可以作为RNase并断裂DNA;在DNA片段5′端连上EDTA. Fe ,可选择性断裂DNA双链 ,起到酶的作用。Komiyana[22]也设计了一个 5′端连接乙二胺(ethylenediamine) 的DNA片段作为RNase水解tR2NA phe.Li 和Nicolaon[23]报道一段人工合成的双链回文结构DNA(palindromic duplex DNA)在没有蛋白质的情况下,能够促成另外两个单链片段连接起来,新链与双链中的一条是同向平行互补的,从而形成三螺旋DNA(triplex DNA)。另外,离子诱导DNA水解也提示DNA可能具有自催化水解的作用[24]。1994 年 deoxyribozyme的概念终于出现了。美国加州大学Lajolla分校的 Joyce G F 和Breaker R R 利用体外选择技术得到了一个35 bp 的单链多聚脱氧核糖核苷酸,在 Pb2+存在的条件下,该DNA能水解特定位置上插入腺苷酸(rA)的DNA,即rA2G之间的磷酸二酯键 [25] ,Joyce据此提出了“DNA 世界”(DNA world)的概念。在这一年里Usman等人[26]化学合成了一个由14个脱氧核糖糖核苷酸组成的单链DNA片段,它具有类似 ribozyme的锤头结构,能够较弱地水解 RNA磷酸二酯键。同年,Cuenound[27]从许多随机序列池中筛选到一些具有2个保守序列的DNA,这种DNA能催化两个DNA片段的连接，其中一个片段的3′磷酸上接有活化该片断的咪唑基。而且他们根据这种DNA的序列设计出由47个脱氧核糖核苷酸组成的单链DNAE 47 ,在Zn2+存在的条件下它可以连接两个单链DNA底物,其连接速率比由单链互补模板催化的连接反应的起始速率高3400倍,比无模板背景连接至少高105倍。也是在这一年里，王身立等[28,29]地发现绿豆基因组DNA具有催化乙酸萘酯水解的酯酶活性,随后他们又发现小牛胸腺和蜘蛛[30]鱼精[31]、鸡[32]和人胚[33]基因组DNA 均具有酯酶活性,并对其检测方法进行了探讨[34]。另外,戴君惕等 [35,36]发现小麦DNA也有酯酶活性。1997年,石东乔发现DNA具有促进二甲基对苯二胺(PADD)与α2萘酚(α2NP)显色的作用。随后佘华证明DNA在这一过程中表现出一种氧化2还原酶类性质，并对 DNA的氧化性、还原性以及氧化2还原酶类性质进行了探讨。 （三）研究的性RNA和DNA的意义

自80年代初发现RNA具有酶活性以来,又陆续发现了其他RNA催化剂，并人工制造出许多RNA催化剂。酶性RNA和DNA的发现具有重要的理论和实际意义。起初，人们称酶性RNA 为\"ribozyme(核酶)\"，随着酶性DNA的发现，ribozyme

的概念也不仅指酶性RNA,同时也应包括酶性DNA.核酶的发现使人们从此不再认为生物化学反应都是由蛋白质催化的，许多复杂的由RNA和蛋白质构成的顺粒具有特别重要的生物学功能，如核糖体,剪接体，加工体和信号识别蛋白质。RNA具有的催化功能使人们必须重视RNA分子在这些颗粒中的地位和作用；酶性RNA的底物是RNA,其作用位点有着高度的特异性，可以用来切割特定的转录产物。有人将这种切割作用叫做抗基因活性，因为切割的结果破坏RNA, 也就抑制了基因的表达。目前正在研究酶性RNA在抗爱滋病和抗储等医疗方面的应用。由于酶性DNA比RNA更稳定，（DNA分子戊搪的2位碳原子上是氢，RNA的则是羟基，而羟基很容易氧化。）因此，在医疗上酶性DNA可能将较酶性RNA具有更广泛的前途。此外,酶性 DNA的发现对研究生命起像也有重要意义。80年代初 ,发现酶性RNA后，人们又认为RNA是最先起深的生命物质，90年代中期，发现了DNA也具有酶活性,由于DNA的复制能力与稳定性均远远大于RNA, 因而目前生物学界亦有人认为DNA 是最早起稼的生命物质。根据分子生物学的“中心法则”，DNA要先转录出RNA, 再转译出蛋白质之后，才能表达酶的活性来。现在发现DNA本身就具有某些酶的活性，这对“中心法则”也是一个重要的补充和发展。 二、脱氧核酶(deoxyribozym e 或DNA zym e)

这是20世纪90年代中后期发现的一类具有酶活性的DNA分子，它的发现是人类对于酶的认识的又一次重大飞跃。Carm i等通过体外选择技术合成了1种依赖于Ca2+的具有自我切割功能的二级结构的脱氧核酶分子。San to ro和Joyce等也通过体外选择技术提出了一种通用于RNA切割的脱氧核酶分子，它由15个脱氧核苷酸构成催化特性结构域，两边分别连有7~ 8个脱氧核苷酸构成的底物识别结构域。脱氧核酶也具有酶的基本特性，如催化效率高、底物专一性等。它的催化效率决定于底物结合的速率，而它的专一性是酶底物以Watson2C rick碱基配对形成二联体或三联体识别方式所决定的。另外，脱氧核酶的活性常依赖一些二价金属离子，如Mg2+、Zn2+、Cu 2+、Pb2+ 、Ca2+ 和Mn2+等，每一种脱氧核酶依赖的二价金属离子种类和程度都有差别，具有特异性。有些脱氧核酶还能利用氨基酸或精胺作为辅助因子。现已发现的脱氧核酶有3种活性：连接酶活性、金属螯合酶活性和磷酸酯酶活性。核酶和脱氧核酶的发现不仅打破了蛋白质对生物催化剂的一统天下，而且还大大地促进了有关生命起源和生物进化等问题

的进一步探讨。由于DNA和RNA集遗传信息储存传递作用和酶学催化作用于身，因此生命起源的最新理论强调DNA和RNA这两类核酸物质的原始作用，也许生命的早期起源及其生化机制是由核酸(包括DNA和RNA)开端的，其催化是自身催化。 （一）脱氧核酶的几种结构

Carmi等[2]通过体外选择技术合成了一种依赖Ca2+的具有自我切割功能的手型二级结构脱氧核酶分子(图1)。茎Ñ是结合部位，茎Ò是催化部位。结合部位不同的碱基序列可以识别不同的底物；催化部位则相对保守。由于结合部位碱基配对是催化剂识别底物的基础， 延长茎Ñ序列可以增加酶2底物复合物的稳定性，但序列过长则会造成DNA分子自我构建( self2structure)，降低茎Ò催化部位的催化活性。主要切割位点在14，也可能通过氧化切割机制在偏离主要位点的区域进行切割。

Santoro和Joyce等[3]通过体外选择技术提出了一种通用于RNA切割的脱氧核酶分子(图2)。它由15个脱氧核苷酸构成催化特性结构域，两边分别连有7~ 8个脱氧核苷酸构成的底物识别结构域。RNA底物通过Watson2Crick碱基配对形式与酶结合，未配对的嘌呤和配对的嘧啶残基之间构成特异性磷酸二酯键切割位点。改变识别结构域的DNA序列，可作用于不同的靶RNA底物。

Breaker等[4]提出一种依赖Pb2+的脱氧核酶分子结构。与酶相结合的底物中有一个核糖核苷酸被多个脱氧核糖核苷酸包住，通过分子内反应在rA处反式切割磷酸二酯键。Sen等[5]研究了稀土元素镧族离子(铽、铥、镧)取代Pb2+作为辅助因子而发挥作用的机制，表明镧族离子依赖性反映了诸如协作所必要的空间、水合离子的pKa值以及离子路易斯酸性等因素的综合。Cuenoud等[6]设计了具有连接酶活性的DNA分子。47个核苷酸组成单链DNA2E47，使3c2磷酸咪唑基和5c2羟基在空间上接近,从而连接两个底物DNA2S1和2S2。E247小的缺失可导致其活性的严重丧失。E247催化机制是酸碱催化，其中金属离子复合物参与质子转移，但不排除可能存在pH依赖的折叠效应等机制。

脱氧核酶也具有酶的基本特性，如催化效率高、底物专一性等。它的催化效率决定于底物结合的速率，而它的专一性是酶底物以Watson2C rick碱基配对形成二联体或三联体识别方式所决定的。另外，脱氧核酶的活性常依赖一些二价金属离子，如Mg2+ 、Zn2+、Cu2+、Pb2+、Ca2+和Mn2+等，每一种脱氧核酶依赖的二价金属离子种类和程度都有差别，具有特异性。有些脱氧核酶还能利用氨基酸或精胺作为辅助因子。

（二）脱氧核酶的应用和生物学意义

现已发现的脱氧核酶有三种活性：连接酶活性、金属螯合酶活性和磷酸酯酶活性，其中后一种特性尤为引人注目。Santoro等[7]发现脱氧核酶10223能在RNA

的A#U位点切割，因而理论上可切割任何mRNA的起始密码AUG,这就等于几乎找到了所有蛋白表达的，同时也为治疗由RNA病毒感染引起的疾病提供了一条新途径。由于脱氧核酶 10223能用于切割生物学上相关的RNA分子，现已进行了与HIV2 Ñgag / pol、env、vpr、tat 和 nef 的mRNA转译起始区15~17个单核苷酸一致的合成底物的切割实验，每一种底物都在预期的位点切割，特异、高效。脱氧核酶10223无疑是一种潜在的强有力的RNA特异性切割工具，无论是在体外应用于RNA性内切酶，还是在生物系统内作为RNA水平上的基因失活剂。由于DNA和RNA既能储存遗传信息又能催化反应，因此生命起源的最新理论强调DNA和RNA这两类核酸物质的原始作用。

比较DNA和RNA这两类物质的特性，似乎研究早期生命起源DNA合成途径更为重要。也许生命的早期起源以及生化机制是由核酸(包括DNA和RNA)开端的，其催化是自身催化。我们可以假设，最初的核酸是既能储存遗传信息又能催化反应的，但由于核酸的相对保守性，在漫长的生命进化过程中，核酸(主要是DNA)只保留下了储存遗传信息的功能，而催化反应的功能逐渐被适应性更广、功能更强的蛋白质酶所取代。前述脱氧核酶、核酶和蛋白质酶催化机制的相似性，也许是这一假设的有力证据。

研核酶和脱氧核酶的发现不仅打破了蛋白质对生物催化剂的一统天下，而且还大大地促进了有关生命起源和生物进化等问题的进一步探讨。由于DNA和RNA集遗传信息储存传递作用和酶学催化作用于一身，因此生命起源的最新理论强调DNA和RNA这两类核酸物质的原始作用，也许生命的早期起源及其生化机制是由核酸(包括DNA和RNA )开端的，其催化是自身催化。 三、展望

生物催化剂提供人们一类在常温、常压、温和条件下加速化学反应的工具。由于发现在极端环境中它能保持稳定性和高活力,科学家们进一步利用这些特点去考虑和开拓这些生物催化剂的新的应用领域,对生物催化剂在高温、低温、高压、高盐浓度、氧化剂、有机溶剂、碱性、卤化物等条件下性能的认识水平，预计在未来数年内将有大幅度的提高。

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