第2期王紫薇ꎬ等:淡竹叶黄酮提取工艺优化及抗氧化性研究
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淡竹叶黄酮提取工艺优化及抗氧化性研究
王紫薇1ꎬ涂明锋1ꎬ叶文峰1∗ꎬ彭 靖2
(1.宜春学院化学与生物工程学院ꎬ江西宜春 336000ꎻ2.宜春市人民医院Ⅰ期临床研究室ꎬ江西宜春 336000)
摘要:目的优化淡竹叶黄酮提取工艺ꎬ并对其抗氧化性进行研究ꎮ方法:采用超声波辅助提取的方式ꎬ以乙醇为提取溶剂ꎬ考察乙醇浓度、超声时间、超声功率对黄酮提取率的影响ꎬ在单因素的基础上进一步通过响应面法对提取工艺进行优化ꎮ通过测定淡竹叶黄酮对清除DPPH、O2-、OH的能力对其抗氧化活性进行评价ꎮ结果:超声波辅助提取淡竹叶黄酮最佳工艺参数:乙醇浓度68%、提取时间27min、超声功率305Wꎬ在此条件下淡竹叶黄酮的提取率为2.11%ꎮ淡竹叶黄酮清除DPPH、O2-、OH自由基IC50分别为1.12mg/mL、0.82mg/mL、0.19mg/mLꎮ结论在条件为乙醇浓度68%、提取时间27min、超声功率305W下ꎬ黄酮提取率最高ꎬ并具有一定的抗氧化活性ꎮ
关键词:淡竹叶ꎻ黄酮提取率ꎻ超声波ꎻ抗氧化
中图分类号:R284ꎻR285 文献标识码:A 文章编号:1008-021X(2020)2-0017-04
StudyonOptimizationofExtractionTechnologyandAntioxidationofFlavonoidsfromBambooleaves
(1.ColledgeofchemistrybioengineeringꎻYichunUniversityꎬJiangxiꎬYichun 336000ꎬChinaꎻ
2.PhaseⅠclinicaltrialwardofthepeople'sHospitalofꎬYichun 336000ꎬChina)
Abstract:ObjectiveTheextractionprocessofflavonoidsinBambooleaveswasoptimizedandItsantioxidantactivitywasstudied.MethodsUsingultrasonic-assistedextractionꎬethanolasextractionsolventꎬtheeffectsofethanolconcentrationꎬultrasonictimeandultrasonicpowerontheextractionrateofflavonoidswereinvestigated.Basedonthesinglefactorꎬtheextractionprocesswasfurtheroptimizedbyresponsesurfacemethod.TheantioxidantactivityofflavonoidsfromBambooleaveswasevaluatedbymeasuringtheabilityofflavonoidstoscavengDPPHꎬO2-andOH.ResultsTheoptimumtechnologicalparametersofultrasonicassistedextractionofflavonoidsfrombambooleaveswereasfollows:ethanolconcentration68%ꎬextractiontime27minꎬultrasonicpower305W.Undertheseconditionsꎬtheextractionrateofflavonoidsfrombambooleaveswas2.11%.TheIC50ofscavengingDPPHꎬO2-andOHradicalbyflavonoidsfrombambooleaveswas1.12mg/mLꎬ0.82mg/mLand0.19mg/mLꎬrespectively.ConclusionsUndertheoptimizedextractionprocesswhichareethanolconcentration68%ꎬextractiontime27minandultrasonicpower305Wꎬtheextractionrateofflavonoidsisthehighestandhasacertainantioxidantactivity.Keywords:lightbambooleavesꎻextractionrateofflavonoidsꎻultrasoundꎻantioxidation 淡竹叶为禾本科植物淡竹叶(LophatherumgracileBrongn)的干燥茎叶ꎬ含有三萜类、黄酮类、酚性成分、多糖类等化合物ꎬ其中以黄酮类为主ꎬ现代药理学研究表明ꎬ淡竹叶具有抑菌、抗氧化、抗病毒、调节血脂、抗肿瘤、解热利尿、调节血糖等作用[1-5]ꎮ淡竹叶在临床上应用较为广泛ꎬ已开发成像小儿退热口服液、口炎片、复方西羚解毒丸等制剂ꎬ淡竹叶所含有的黄酮类等化合物ꎬ在具有抗氧化、延缓衰老等功效的保健食品开发上也有着十分巨大的应用前景[6]ꎮ
实验采用超声波辅助提取淡竹叶中黄酮类化合物ꎬ通过响应面软件对实验选取的乙醇浓度、提取时间、超声功率等主要影响因素单一作用及交互作用进行更深入的研究ꎬ从而得出最佳提取工艺条件ꎬ并对淡竹叶黄酮的抗氧化性能进行研究ꎬ为淡竹叶的开发应用提供理论依据[7-8]ꎮ
淡竹叶(购于宜春市神农堂大药房)ꎬ芦丁标准品(上海源叶生物科技有限公司)ꎬ亚钠、铝(国药集团化学试剂有限公司)、无水乙醇、95%乙醇、30%H2O2、FeSO4、水杨酸、Tris-Hcl缓冲液、邻苯三酚(均购于国药集团化学试剂有限公司)ꎬ
DPPH(阿拉丁试剂有限公司)ꎬ以上试剂均为分析纯ꎮ
BS223S天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)ꎻ752N紫外可见分光光度计(上海佑科仪器有限公司)ꎻSK8210LHC超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)ꎮ
WangZiwei1ꎬTuMingfeng1ꎬYeWenfeng1∗ꎬPengJing2
2 实验方法
2.1 黄酮含量测定
1 实验材料与仪器
2.2 单因素实验
标准品ꎬ参照文献[9-10]ꎬ并稍作修改ꎮ在510nm处测得标准曲线回归方程为:Y=0.0095X-0.0317ꎬR2=0.9964ꎮ然后测定黄酮提取液的吸光度ꎬ代入标准曲线方程得到待测液中样品浓度ꎬ再根据提取率公式求出淡竹叶黄酮的提取率ꎬ提取率公式如下:
C×V×N
黄酮提取率=×100%
1000×m
式中:C为黄酮浓度ꎬmg/mLꎻV为样品溶液体积ꎬmLꎻN为稀释倍数ꎻm为淡竹叶粉末质量ꎬgꎮ
以黄酮提取率为评价指标ꎬ探究乙醇浓度(45%、55%、
采用NaNO2-Al(NO3)3比色法测定黄酮含量ꎬ以芦丁为
收稿日期:2019-11-29
基金项目:江西省“2011协同创新中心”(天然药物活性成分研发与应用)
作者简介:王紫薇(1997—)ꎬ女ꎬ河北唐山人ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向:药物研发与生产技术ꎻ通信作者:叶文峰(1966—)ꎬ女ꎬ硕士ꎬ教授ꎬ江西萍乡人ꎬ主要从事天然产物的研究与开发ꎮ
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山 东 化 工
SHANDONGCHEMICALINDUSTRY
2020年第49卷
2.3 响应面实验设计
65%、75%、85%)、提取时间(5min、15min、25min、35min、45min)、超声功率(200W、250W、300W、350W、400W)对淡竹叶中黄酮提取率的影响ꎮ
依据单因素实验结果ꎬ进行响应面实验设计ꎬ对黄酮提取工艺条件进行优化ꎮ因素与水平如表1所示ꎮ
3.1.2 提取时间对淡竹叶黄酮提取率的影响
由图1可看出ꎬ不同浓度的乙醇溶液作溶剂ꎬ黄酮提取率有所不同ꎬ乙醇浓度<65%时ꎬ黄酮提取率随着乙醇浓度的增大而升高ꎬ乙醇浓度>65%时ꎬ黄酮提取率随着乙醇浓度的增大而降低ꎬ由此可以确定乙醇的最佳浓度为65%ꎮ
提取时间对淡竹叶黄酮提取率的影响结果如图2所示ꎮ
表1 响应面实验因素与水平设计
因素水平
A-乙醇浓度/%
55-1
0
1
B2.C--提取时间超声功率/mi)/W
15653002575350352.4.4 1 淡竹叶黄酮抗氧化性研究
250
淡竹叶黄酮对超氧阴离子的清除作用[11]
配制不同浓度的淡竹叶黄酮溶液ꎬ取1.0mL不同质量浓度的样品溶液于比色管中ꎬ分别加入4mLTris-Hcl缓冲液ꎬ25℃水浴加热20minꎬ分别加入0.3mL5mmol/L邻苯三酚溶液ꎬ混匀ꎬ于420nm处检测各组吸光值ꎬ空白对照组用相同体积的蒸馏水替代样品ꎬ按如下公式进行计算:
超氧阳离子清除率(%)=A0-Ax
2.4.2 式中淡竹叶黄酮对羟自由基的清除作用:AA0
×100%
0为空白对照组吸光度ꎻAx为样品组吸光度ꎮ
[12]
3mL取=7.7.4)、2mL5mmol1.0mL/不同质量浓度的样品溶液于比色管中0.L水杨酸75mmol-/L乙醇溶液FeSO4以及、3mL2mL磷酸盐缓冲液ꎬ分别加入0.01%双氧水(pHꎬ值混匀ꎬ37℃水浴30minꎬ于510nm羟自由基清除率=(1-A处测吸光值ꎮ计算公式如下:
x-Axo
)×100%式中样品溶液吸光度值ꎻAxo为样品本身吸光度值Ao
:Ax为不同
ꎻAo为对照液吸光度值2.4.3 ꎮ
4mL取1.淡竹叶黄酮对0mL不同质量浓度的样品溶液于比色管中DPPH的清除作用[13]
ꎬ517nm0.DPPH处测定吸光度值1mmol/LDPPH溶液ꎬ混匀ꎬ放置在暗处反应分别加入30minꎬ于自由基清除率ꎮ计算公式如下=(1-Ax式中:A为不同样品溶液吸光度值A-o
Axo
:
)×100%
xꎻA3 1mL乙醇+4mLDPPHxo为1mL样品+4mL乙醇吸光度值ꎻAo为吸光度值ꎮ
3.3.1.1 实验结果与讨论
1 单因素实验结果与讨论
乙醇浓度对淡竹叶黄酮提取率的影响结果如图乙醇浓度对淡竹叶黄酮提取率的影响
1所示ꎮ
图1 乙醇浓度对黄酮提取率的影响
图2 提取时间对黄酮提取率的影响
由图2可看出ꎬ所用的提取时间不同ꎬ竹叶黄酮的提取率也有所不同ꎬ当提取时间处于5~25min区间时ꎬ黄酮提取率随着提取时间的增加而升高ꎻ当提取时间处于25~45区间时ꎬ黄酮提取率随着提取时间的增加而降低ꎬ表明25min应为最佳提取时间3.1.3超声功率对淡竹叶黄酮提取率的影响结果如图 ꎮ
超声功率对淡竹叶黄酮提取率的影响
3所示ꎮ
图3 超声功率对黄酮提取率的影响
由图3可看出ꎬ超声功率不同ꎬ淡竹叶黄酮提取率也有所不同ꎬ当提取功率处于200~300W区间时ꎬ黄酮提取率随着提取功率的增大而升高ꎻ当提取功率处于300~400W区间时ꎬ黄酮提取率随着提取功率的增大而降低ꎬ表明300W为最佳超声3.功率ꎮ
3.2.2 1 响应面实验结果及分析
根据响应面实验结果
2.3设计的因素水平ꎬ采用Box-Beknhen实验设计原理进行实验设计ꎬ并对每组方案进行试验ꎬ得出相应的黄酮提取率ꎬ设计及结果如表2ꎮ
表2 响应面法设计与试验结果
实验号A乙醇浓度
B提取时间
C超声功率
黄酮提取率%
12-3-1-04111
101.1.5950-06
00101.961
0102.950
2.071.0698
第2期
表2(续)
实验号781011121314151617
项目模型ABC9
A乙醇浓度
-1-1100100000
B提取时间
00000-1-1101平方和0.0390.0630.0111.600E-003
0.0130.0270.0808.405E-0036.125E-0032.080E-003
0.320.0360.0290.320
王紫薇ꎬ等:淡竹叶黄酮提取工艺优化及抗氧化性研究
3.2.2 建立模型方程与显著性检验
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C超声功率
-1-100-1-101111
黄酮提取率%
1.811.931.942.102.091.981.691.871.962.121.91
根据表2中实验数据进行多项拟合回归分析ꎬ得到淡竹叶黄酮提取率(Y)对乙醇浓度(A)、提取时间(B)、超声功率(C)的二次多项回归模型方程:
Y=2.09+0.07A+0.089B+0.036C-0.085AB-0.02AC-0.058BC-0.08A2-0.14B2-0.093C2
表3 响应面二次回归方程方差及显著性分析
自由度911111111173416
均方0.0350.0390.0630.0111.600E-003
0.0130.0270.0801.201E-0032.042E-0035.700E-004
0.0360.029
F值29.1732.6552.4824.0711.0122.5866.5430.173.581.338.76
Prob>F<0.00010.00070.00020.02110.00170.28620.0128<0.00010.00090.12480.0021
显著性∗∗∗∗∗∗∗∗∗∗∗∗∗∗∗∗--∗
ABACBCA2B
22
C残差失拟向纯误差总和
注:∗表示P<0.05ꎬ显著差异ꎻ∗∗表示P<0.01ꎬ极显著差异ꎻ-表示P>0.05ꎬ差异不显著ꎮ
二次多项回归方程方差及显著性分析见表3ꎬ该模型的P<0.0001ꎬ表明二次多项式模型整体上比较显著ꎬ失拟项检验的P=0.1248>0.05ꎬ表明失拟项检验不显著ꎬ方程的相关系数R2=0.9607ꎬ可知该方程对实验拟合较好ꎬ可以对实验进行预测ꎮ一次项A、B、AB和BC的交互项及A2、B2和C2二次项对黄酮提取率均具有极显著差异ꎻ一次项C对黄酮提取率具有显著差异ꎻAC交互项对黄酮提取率不具有显著性影响ꎬ各因素对多糖
得率影响大小依次为B>A>Cꎬ即超声时间>乙醇浓度>超声功率ꎮ
3.2.3 响应面分析
利用Design-Expert软件对各因素间交互作用进行分析ꎬ得到响应面图以及等高线图ꎬ结果见图4至图6ꎮ
图4 乙醇浓度与提取时间对黄酮提取率影响的响应面(左)和等高线(右)
图5 乙醇浓度与超声功率对黄酮提取率影响的响应面(左)和等高线(右)
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山 东 化 工
SHANDONGCHEMICALINDUSTRY
2020年第49卷
3.3 淡竹叶黄酮抗氧化性能试验结果
图6 提取时间与超声功率对黄酮提取率影响的响应面(左)和等高线(右)
双曲面坡度平缓表示2个因素交互作用不显著ꎬ坡度陡峭淡竹叶黄酮对DPPH、O2-、OH自由基具有一定的清除表示2个因素交互作用显著ꎻ等高线的密集程度和形状可反映效果ꎬ并且清除效果随着淡竹叶黄酮质量浓度的增加而增强ꎬ出交互效应的强度大小ꎬ等高线越密集ꎬ说明二者交互作用越IC50分别为1.12mg/mL、0.82mg/mL、0.19mg/mLꎮ显著ꎻ椭圆形表示2个因素交互作用显著ꎬ圆形则表示2个因素参考文献的交互作用不显著ꎮ图4~图6中ꎬ图4与图6中等高线图近[1]中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典(一部)似椭圆ꎬ倾斜度相对图5更高ꎬ表明两张图片所对应的交互因[M].北京:中国医药科技出版社ꎬ2015ꎬ328.素的交互作用明显ꎬ图5中等高线图近似圆形ꎬ则表明该图片[2]李 烨ꎬ朱志强ꎬ集 贤ꎬ等.响应面优化超声波法提取竹中的交互因素交互作用不明显ꎮ
叶黄酮[J].西华大学学报(自然科学版)ꎬ2019ꎬ38(05):
3.2.4 最佳工艺条件的确定与验证试验
78-83.
通过响应面软件可以得出ꎬ试验最佳工艺参数为乙醇浓度
[3]史 洋ꎬ刘 峰ꎬ杨东花ꎬ等.淡竹叶药效物质基础研究进
68.15%ꎬ提取时间27.04minꎬ超声功率304.91Wꎬ该条件下淡
展[J].中国现代中药ꎬ2014ꎬ16(7):597-600.
竹叶黄酮提取率为2.11%ꎬ为了试验操作的可行性与便利性ꎬ
[4]陈 烨.淡竹叶化学成分与药理作用研究进展[J].亚太
将工艺条件调整为乙醇浓度68%ꎬ提取时间27minꎬ超声功率
传统医药ꎬ2014ꎬ10(13):50-52.305Wꎮ采用最佳工艺条件提取淡竹叶黄酮3次ꎬ进行验证性实
[5]WangLꎬBaiMꎬQinYetal.ApplicationofIonicLiquid-验ꎬ三次试验中淡竹叶黄酮提取率平均值为2.08%ꎬ与理论值
BasedUltrasonic-AssistedExtractionofFlavonoidsfrom2.11%相近ꎬ表明采用响应面法优化得到的最佳工艺条件准
BambooLeaves.[J].Moleculesꎬ2018ꎬ23(9).确ꎬ具有一定的可行性ꎮ
淡竹叶黄酮对O2-、OH、DPPH的清除作用结果见图7ꎮ
[7]陈俊其ꎬ秦华珍ꎬ尹 优ꎬ等.山姜属中药黄酮类成分提取[8]张海容ꎬ白 娟ꎬ魏增云ꎬ等.超声萃取-响应面法优化淡
竹叶多糖提取方法研究[J].化学研究与应用ꎬ2013ꎬ25(03):303-310.
[9]范秀芝ꎬ殷朝敏ꎬ叶罗娜ꎬ等.黑木耳发酵菌质总黄酮体外[10]梁艳妮ꎬ唐志书ꎬ张晓群ꎬ等.马齿苋总黄酮的超声波辅助
提取工艺优化及其抗氧化、抗肿瘤活性研究[J].中国农学通报ꎬ2019(04):130-135.
[11]徐望龙ꎬ李云贵ꎬ孙林军ꎬ等.山银花黄酮粗提物抗氧化活
图7 黄酮抗氧化性能结果图
由图7可知ꎬ淡竹叶黄酮对这三种自由基具有一定的清除作用ꎬ并且清除效果随着淡竹叶黄酮质量浓度的增大而增强ꎬ但清除能力均比VC弱ꎮ当淡竹叶黄酮为0.5mg/mL时ꎬ对O2-、OH、DPPH清除率分别为40.2%ꎬ73.0%ꎬ34.4%ꎬ表明在相同质量浓度下ꎬ淡竹叶黄酮对OH的清除效果最好ꎮ通过单因素试验和响应面优化得到淡竹叶黄酮提取最优条件为乙醇浓度69%ꎬ提取时间27minꎬ超声功率304Wꎮ
[12]齐佳慧ꎬ韩秋菊ꎬ王菲ꎬ等.木贼麻黄多糖的提取及体外抗[13]郑朋朋ꎬ李珊ꎬ戚丽蓉ꎬ等.山楂多糖的提取及其抗氧化性
作用[J].中国酿造ꎬ2015ꎬ34(06):107-113.
(本文文献格式:王紫薇ꎬ涂明锋ꎬ叶文峰ꎬ等.淡竹叶黄酮提取20.)
工艺优化及抗氧化性研究[J].山东化工ꎬ2020ꎬ49(2):17-
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氧化活性研究[J].中国现代应用药学ꎬ2018(09):1342-性的体外观察[J].中成药ꎬ2014ꎬ36(6):1292-1294.抗氧化活性研究[J].核农学报ꎬ2019ꎬ33(02):313-321.2302-2307.
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[6]焦 坤.淡竹叶化学成分的分析方法研究进展[J].广州化
及分离富集方法研究进展[J].中医学报ꎬ2019ꎬ34(11):
4 结论