大胡蜂蜂毒中多肽和蛋白质结构和功能的多样性

李龙星3 ,4 ,袁仕梦1 ,2,杨自忠1 ,2,3,杨志斌.2 ,3 **,张成桂.2,3 *

1大理大学云南省昆虫生物医药研发重点实验室;2大理大学药用特种昆虫开发国家地方联合工稈研究中心；

3大理大学中国西南药用昆虫及蛛形类资源开发利用协同创新中心;\"大理大学分析测试中心，大理671000摘 要:为证明大胡蜂Vespa magmfica(Smith)蜂毒具有较大的药用开发价值，本研究采用超高效液相色谱-质谱和电 泳技术对其多肽和蛋白质的分布进行分析，发现其蛋白质的相对分子质量主要分布在17-45 kDa范围内。蜂毒多 肽类物质的相对分子质量呈“单M”式分布,61%在500 -3 000 Da范围内，为大胡蜂蜂毒中多肽含量最为LK的部

分。通过牛津杯法对蜂毒的抑菌活性进行研究，且以HepG2人肝癌细胞及B16黑色素瘤细胞为研究对象，用MTT 法检测蜂毒的细胞毒性活性，证明其具有良好的抑菌作用和细胞毒活性,其结果与已报道的其他蜂类既有相似性又

存在具体差异，展示了大胡蜂蜂毒的分子多样性,为后续该毒素的物质基础研究及药用价值开发提供参考。关键词:蜂毒;多肽;蛋白质;多样性;抗菌;细胞毒活性中图分类号:R932

DOI： 10.16333/j.1001-6880.2019.9.017文献标识码：A 文章编号：1001(6880 (2019) 9-1596-06Determination of peptide and protein diversity in venom of Vespa magnified (Smith) on structure and functionZHOU Si-tong1，2,CHE Yi-hao'\" ,NI Lian-li1^ ,LI Long-xing3,4 , YUAN Shi-meng1，2,

YANG Zi-zhong1-2,3 ,YANG Zhi-biJ\"* ,ZHANG Cheng-gui1-2,3 *1 Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Bioph.armaceutical R&D, Dali University2National-local Joint Engineering Research, center of Entomoceutics Dali University3 Yunnan Provincial Collaborative Innovation Center for Entomoceutics, Dali University4Analyzing and Testing Center, Dali University Dali 671000, ChinaAbstract:In order to prove that Vespa magnifica ( Smith) venom has great medicinal purposes development value. In this

study, the distribution of molecular mass of peptides and proteins was analyzed by Ultra Performance Liquid Chromatography­

Electrospray-Quadrupole-Time of Flight Mass Spectrometry ( UPLC-ESI-Q-TOF-MS) and Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacryl- amide Gel Electrophoresis ( SDS-PAGE). The relative molecular mass of the proteins is mainly distributed in the range of 17

to 45 kDa. The peptides present a unimodal distribution and 61% of them are in the range of 500-3 000 Da, which is the most

abundant part of the crude venom of V. magnified. The antibacterial activity of the venom was studied by Oxford Cup method.

HepG2 human hepatoma cells and B16 melanoma cells were used as the research object to evaluate the cytotoxic activity of the venom by MTT assay,which proved the potential antibacterial activity and cytotoxic activity. The results have similarities

and specific differences with other reported bees and wasp, showing the molecular diversity of the venom and providing refer­

ence for the subsequent material research and medicinal value development of the venom.Key words: Vespa magnified ( Smith) venom ； peptides ； proteins ； diversity ； antibacterial cytotoxic activity大胡蜂Vespa magnifica( Smith)在云南地方习称

收稿日期：2019-05-24 接受日期：2019-08-13基金项目：国家自然科学基金(81360679);云南省应用基础研究

青年项目(2016FD074);云南省科技创新平台建设项目 (2015DG030)* 通0作者 Tel：86-872-2214251 ;E-mail：79204431@ 163-com:cheng-

gui_zcg@ 163 - com

土蜂、黄土：等，是景颇族民间传统运用的蜂类昆虫

药之一。主要分布在我国的西北地区，包括云南、四

川、等地,在越南、缅甸、印度等也有所分布。早 在《本草纲目》中对于土蜂及其蜂房、幼虫便有所记

Vol.31周思彤等:大X蜂蜂毒Q多肽和蛋门质结构和功能的多样性1597载,主治蜘蛛咬疮、痈肿、利大小便等，《中国药典》

(2015版)第一部中收载了胡蜂酒，用于风湿闭阻所 致的痹病，如关节疼痛、肢体沉重等,对于急性风湿

病、风湿性关节炎等有治疗效果⑴O蜂毒中含有多种生物活性成分,包括小分子化 合物、高丰度的肽、蛋白和过敏原等,其作为一种药

用资源引起了人们的广泛关注，现已逐渐成为生物

毒素研究的新热点r2'31o目前，对于大胡蜂蜂毒的

研究主要集中在活性物质的分离与鉴定方面，已成 功分离出具有抗菌、抗凝血及磷脂酶活性的肽和蛋 白类物质\"\\大胡蜂蜂毒中的多肽和蛋白质成分复杂且具有

多种药理活性，目前对其的研究报道尚不全面。在

本实验中，利用超高效液相色谱-电喷雾-四极杆-飞

行时间质谱技术和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝

胶电泳技术分析了大胡蜂粗毒中多肽和蛋白质的组 成，首次对该蜂毒所富含的多肽与蛋白质的多样性

进行了探索，同时对蜂毒的抑菌活性进行初步研究。

已有研究表明，蜂毒肽(Melittin)可抑制黑色素瘤及

肝癌细胞，故本实验通过使用MTT法检测大胡蜂蜂

毒对HepG2人肝癌细胞及B16黑色素瘤细胞的细

胞毒活性，为后续对该毒素的物质基础研究及药用

开发提供参考依据。1材料与方法1.1试验材料质谱仪(Compact QTOF, Bruker)，超高效液相色

谱仪(UltiMate 3000,戴安)，电子天平(BSA124S，赛

多利斯)，垂直电泳仪(Mini-Protein, Bio-Rad)，低温 高速离心机(5430R,Eppendorf),冷冻干燥机(FD8-

4a,GOLD-SIM) ,C02 培养箱(3111,Thermo)，酶标仪

(SN255939,BIO-TEK)。SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒(20171120 , Solar­

bio ),SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液(101218181015,

碧 2 天),甘氨酸(418Q066, Solarbio ) , Tris (527K073, Solarbio) , SDS (323A033 , Sigma) , Marker

(20160425, Solarbio 180 kDa-11 kDa)，考马斯亮蓝 G-250(No. C8430,Solarbio)，乙月青 ACN(178497,TE- DIA)，三氟乙酸 TFA(17040277,TEDIA)，营养琼脂

培养基(20160618,北京奥博星生物技术有限责任公

司)，沙氏琼脂培养(20170426, Solarbio),克霉'溶

液(B1036,广州白2山医药集团股份有限公司)，青 霉素钠(017171048 ,中诺药业有限公司)，RPMI-

10 培养基(1915379, Gibco ),胎牛血清(FBS )

(1828728 ,Gibco)，胰蛋白酶(2046777 ,密理博),嗟

'蓝(MTT) ( ST316, Sigma)，二：基亚枫(DMSO)

(RNBF1095 , Sigma)其他试剂均为国产分析纯,水为

超纯水。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,

25923 ),白色念珠菌(Canidia albicans , 10231)，大肠

埃希氏菌(Escherichia coli ,25922 ),由大理大学基础

医学院提供。HepG2人肝癌细胞株由昆明中国科

学院细胞库提供,B16黑色素瘤细胞株由上海细胞 库提供。1.2昆虫蜂毒取自大胡蜂成虫。虫种收集自2南德宏等

地，由中国科学院2南动物研究所董大志鉴定,现存

于大理大学昆虫生物医药研究院。供试个体的养殖

与取毒均由大理大学昆虫生物医药研究院养殖基地

完成。1.3粗毒收集于蜂群处采用电刺激法进行多次取毒。取毒器 自制，输出电压为12 V,每次采集毒液30 min。收

集足够量的毒液后经真空冷冻干燥得白色或略带黄

色的粉末,即为粗毒粉末，于-20 •保存。1 -4样品处理取一定量的粗毒粉末用超纯水溶解至浓度为

16 mg/mL,于 4 •以 10 000 rpm 离心 5 min,使用 0. 22 pm滤膜滤过,即得。1.5 SDS-PAGE 检测对供试品溶液采用SDS-PAGE的方法进行蛋白

质相对分子质量的测定，使用5%的浓缩胶和12%

的分离胶，具体操作参考凝胶制备试剂盒说明书。

电泳完成后使用考马斯亮蓝G-250进行染色。蛋 白质相对分子质量的计算方法如下：以标准蛋白质

相对分子质量的对数(lgMw)为纵坐标,标准蛋白质

的相对迁移率(Rf)为横坐标绘制标准曲线,得到线

性回归方程及回归系数。将样品的Rf值代入回归

方程计算出其lgMw,从而得到样品的相对分子质

量。Rf值的计算公式为：其中,L1为加样孔至条带中心的距离;L2为加

样孔至漠酚蓝区带的距离。1 - 6 UPLC-ESI-Q-TOF-MS 检测色谱条件:使用超高效液相色谱仪，色谱柱为 Agilent Poroshell 120 EC-C^ ( 3. 0 ° 150 mm, 2. 7

1598天然产物研究与开发Vol.31pm）,流动相为0.1% :酸水溶液（A）-0. 1% :酸

乙r（B），梯度洗脱（0~35 min,5%—54% B；35 ~

49 min,54%—79% B；49 ~58 m^n,79%—95% B）,

流速：0.2 mL/min,进样量：5 “L,检测波长为214

nm,柱温：25 • o质谱条件:使用高分辨质谱仪，离子源采用电喷

雾离子源（ESI），正负离子检测模式，毛细管电压为 3 500 V,扫描范围300 ~3 000 m/z,雾化器气体压力2. 0 Bar,干燥气体流速& 0 L/min干燥加热温度

200 •o1.蜂毒的抑菌活性研究将供试菌制成108 cfu/L均匀的菌悬液，取0.1

mL用无菌涂布环将菌悬液均匀涂布在凝固的无菌

培养基中，放入牛津杯，每个牛津杯加入200 pL的 10 mg/mL的蜂毒水溶液，以无菌水为空白对照，细

菌平板置37 •培养24 h，真菌平板置27 •培养48

h,测定蜂毒对各共试菌的抑菌效果，游标卡尺测定

各抑菌圈的的大小，重复3次。同时，取1 mg/mL

的青霉素钠溶液及0. 15 mg/mL的克霉'溶液为阳

性对“o1.8细胞毒活性研究取对数生长期的HepG2及B16细胞，胰蛋白酶

消化后以5 000个/孔接种于96孔板,设置实验组、 细胞阴性对照组和空白培养基对照组，置于37 •、

5% CO2培养箱中培养24 h后，实验组加160,80,

40、20、10 pg/mL的蜂毒溶液,阴性对照组加入等体

积PBS，每组5个复孔，于培养箱中孵育48 ho弃去 上清液，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 pL,继续孵育 4 h,每孔加入150 pL DMSO溶解：瓒（Formazan）晶

体，于酶标仪上490 nm波长测定各孔的光密度值

（OD值），并计算IC50

生长抑制率（% ） = （ OD值6肚柿如mea\" - OD实验俎mean）/ （OD值6肚才號如i-°D值空百如mea\"）° 100%2结果与分析2.1 SDS-PAGE 检测结果如图1所示，样品的SDS-PAGE最佳上样

量为5从L,凝胶背景清晰，蛋白条带分辨率较高。

电泳图谱中，除相对分子质量在11 kDa以下多肽

外,其他蛋白质主要分布在17 ~45 kDa的区域内，

共有4条分离度较佳的清晰条带。根据标准蛋白质条带绘制成标准曲线（图2）,

得回归方程 y= -1.216 8X+2.299,r 为 0.990 1,abcdf41 kDi34291 KPa Da -—一■■图1大胡蜂蜂毒的SDS-PAGE结果Fig. 1 The SDS-PAGE results in the wasp venom of Vespa magnified ( Smith)

注:a - f.上样量分别为 1 ,2,3 ,4,5 ,6 piNote：a 〜f.

The amount of loading is 1 ,2 ,3 ,4 ,5 and 6 pL‘respectively.图2 SDS-PAGE标准蛋白质相对分子质量标准曲线Fig. 2 The standard curve of molecularweight of SDS-PAGE protein marker其中X代表迁移率（Rf）,『代表相对分子质量的对

数值（lgMw ）o将样品中4条电泳条带的Rf值带入

公式计算,它们的相对分子质量从大到小依次为41、34、29、23 kDa。2- 2 UPLC-ESI-Q-TOF-MS 检测大胡蜂蜂毒的反相超高效液相色谱图和质谱基

峰图（图3 ）显示，大胡蜂蜂毒的成分复杂,在214 nm波长下可以检测到62个色谱峰（大部分色谱峰

峰面积较小）,于40 min内被洗脱（图3A）o经ESI- Q-TOF-MS鉴定（图3B,C） , 10 min内的质谱峰较

少,该时间段的洗脱峰主要是小分子化合物,大部分 质谱峰主要集中在保留时间为10 ~40 mi内，为多

肽类物质,在大胡蜂蜂毒中含量丰富。经对质谱正 负离子模式下的离子峰进行信号归属,去除冗余，大

多数质谱峰中均出现了 2个以上的信号且多为多电 荷离子。这说明很多疏水性相近,但相对分子质量

有差异的多肽分子存在于同一洗脱峰中。本试验共

鉴定得到4个单一成分（表1）oVol. 31周思彤等:大胡蜂蜂毒中多肽和蛋门质结构和功能的多样性1599表1大胡蜂蜂毒中单一成分的相对分子质量Table 1 Molecular weight of single component inthe wasp venom of Vespa magnified ( Smith)保昭吋I tR

(min)5.79- 121.634.0止离子Cation[M + H] +403.225 1负离子Anion[M-H]-[M + HCOOH-H]-569-426 7[2M + H ] +--463.798 3--615.433 0-926.588 91 382.882 2-1 380.950 4-1 426.956 5本实验从大胡蜂蜂毒中检测出160个物质成

分，充分展现了大胡蜂蜂毒的分子多样性情况（图 4A）。大胡蜂蜂毒中多肽的相对分子质量呈“单峰”

图3大胡蜂蜂毒的UPLC色谱图和基峰图(+/-)Fig. 3 The UPLC chromatogram and base peak chromatogram

(+/-) of mass spectrometry in the wasp

分布,61%的分子分布在500 ~3 000 Da区域,其中

有43%分子分布在500 -1 500 Da内，含量最为丰 富，证明此区域的分子可作为大胡蜂蜂毒肽结构与

功能研究的重点目标（图4B）O有14%低于400 Da 的小分子化合物在其中分布。为了直观的展示大胡 蜂蜂毒中所含成分的保留时间、相对分子质量以及

venom of Vespa magnified ( Smidi)注:A.色谱模式；B止离子模式；C.负离子模式。Note： A. The

chromatographic mode ； B. The positive ion mode；C. The negative ion

mode.4C）,由图可知，主要的多肽分子群于15 -35 min的

质谱峰的强度，分别以流分（fraction number）、质荷

保留时间D \" |脱，相对分子质量在500 -2 000 Da

比（m/z）和质谱峰强度（peak intensity）为X轴、Y | |

和Z轴8制大胡蜂蜂毒中各成分的三维分布图（图之间；在保留时间30 min处附近，洗脱出较多的成

分，但含量相对较少。3L5、10'町 JA 轴 畔 J0t'rM±ia linger图4大胡蜂蜂毒的分子多样性Fig. 4 Molecular diversity of the wasp venom of Vespa magnified ( Smith)注:A.结合液相和质谱数据的大胡蜂蜂毒分子质量分布；B.直‘图显示了蜂毒中分子质量的分布频率，曲线显示了蜂毒中液质鉴定成分的 累计总数；C.大胡蜂蜂毒中分子的三维分布图。Note： A. Molecular mass distribution of the wasp venom of ¥espa magnific叭 Smith) by RP-UPLC

and ESI-Q-TOF-MS analysis ；B. The histogram shows the frequency of molecular mass in the wasp venom. The overlaid curve shows the cumulative total

of component masses indentified from UPLC-ESI-Q-TOF-MS analyses ；C.3D distribution of the wasp venom of Vespa magnified( Smith)-2.3抑菌效果分析以抑菌圈的有无及直径大小作蜂毒水溶液抑菌

10. 90 mmo效果的测定指标，蜂毒水溶液对细菌的抑菌效果见

表2。结果显示蜂毒溶液对3种菌的抑菌效果不同，

2.4蜂毒溶液与青霉素钠和克霉瞠溶液抑菌效果 比较如表3所示，青霉素钠对大肠埃希菌及金黄色

对白色念珠菌抑菌效果最明显，其次是金黄色葡萄 葡萄球菌有较好的抑菌作用。将10 mg/mL的蜂毒 水溶液与1 mg/mL青霉素钠溶液与0. 15 mg/mL的球菌,大肠埃希菌在三种菌中最次，抑菌圈直径仅为1600天然产物研究与开发Vol.31表2大胡蜂蜂毒水溶液对细菌及真菌的抑菌直径(mm) ( 0 士 s ,n = 3 )Table 2 The inhibitory zone diameter of wasp venom to tested strains/mm ( x ± s，n -=3)菌种Species金黄色葡萄球菌S. aureus12.45 ±0-27大肠埃希菌E. coli10-90±0-731' 1色念珠菌C. albicans16-77±0-40抑菌圈直径Inhibitory zone diameter (mm)克霉'溶液的抑菌效果进行比较，发现蜂毒溶液对 大肠埃希菌及金黄色葡萄球菌的抑菌为青霉素钠溶

液的51%，对于白色念珠菌的抑菌效果比0.15 mg/mL的克霉'溶液较好。表3青霉素钠及克霉哩对细菌及真菌的抑菌直径(mm )(0±s , n = 3)Table 3 The inhibitory zone diameter of benzylpenicillin sodium and clotrimazole to tested strains(mm) ( x ± s ,n = 3)菌种Species金黄色葡萄球菌

S. aureus大肠埃希菌E. coli1' 1色念珠菌C. albicans-16.03 ±0-50青霉素钠Benzylpenicillin sodium24.35 ±0-7421.33 ±0-20克霉'Clotrimazole--2.5细胞毒活性研究经检测，蜂毒样品的抑制率及IC50如表4所示， 结果显示，随着蜂毒溶液的浓度逐渐升高，对HepG2

成分也高达上千种，且不同种内肽的数量及组成具

有一定的差异，均可作为新型的药用资源W有 文献报道，胡蜂毒液中含有大量的分子量在1 400 ~ 7 000 Da范围内的肽，可占干燥毒液的70% 0121 o在

人肝癌细胞株、B16黑色素瘤细胞株的抑制率逐渐

升高。表4 蜂毒样品对HepG2及B16细胞的

抑制作用(x±s , n = 3)Table 4 The inhibition and IC50 of wasp venom samples本实验结果中，大胡蜂蜂毒多肽成分主要分布在 500 ~3 000 Da区域内，蛋白质主要分布在17 ~45 kDa范围内，其结果与胡蜂Polybia paulista的蜂毒

of HepG2 and B16( x ± s，n = 3)细胞Cell linesHepG2相似,P. paulista的蜂毒在400 ~ 3 000 Da范围内检 测到78 ~ 108种不同的肽，占蜂毒干重的70% 0131 o

样品

Sample (pig/mL)10抑制率Inhibition rateIC50((pg/mL )14-07±0-0244-47±0-0732. 15 ±4-33同样,小黄蜂Vespula vulgaris的蜂毒所含蛋白质的 相对分子质量主要分布在25 ~ 100 kDa范围内「⑷。

这些结果表明大胡蜂与其它蜂在物种进化过程中存

204058.58 ±0- 10在一定的同源性，因此，进一步研究大胡蜂蜂毒与其

他胡蜂毒的蛋白和多肽分子差异性，将有助于了解

8076-60 ±0-0681.02±0.0418.28 ±0-07160B1610其进化及其毒液的生物活性机制。同时，实验结果

29-99 ±5-51显示，大多数的物质含量较低，难以检测和鉴定，其 生物活性与结构功能还需进一步研究。2028.67±0.0973.68 ±0-0380.82±0.0440抑菌实验结果显示，蜂毒水溶液对金黄色葡萄

80

球菌及大肠埃希菌的抑菌效果可达到青霉素钠的

1/2 ,对于白色念珠菌的作用效果与克霉'相似，证

16084.18 ±0-06明其具有抑菌功能。现有研究表明，在胡蜂蜂毒中

3讨论存在着由12 ~ 14个氨基酸组成的具有抗菌作用的 黄蜂毒素(mastoparans)，Xu等「41在大胡蜂蜂毒分离

动物毒素均含有较为丰富的多肽及蛋白质类活 性成分，已知蛇毒中大约含有100种不同的多肽组

鉴定出类似黄蜂毒素的两种抗菌肽，由13 ~ 14个氨 基酸组成。在P- paulista胡蜂中鉴定出的Polybia-

分，蛛毒中含有高达1 018个多肽，芋螺毒液中肽的

Vol. 31周思彤等:大X蜂蜂毒Q多肽和蛋门质结构和功能的多样性1601MP I黄蜂毒素的分子量为1 654. 09 Da,是一种潜

在的高效、高选择性的抗生素；由9-18个氨基酸组 成的激肽相关肽也是胡蜂蜂毒中主要的肽类物质,

具有很强的生理效应「⑴o本实验证明，大胡蜂蜂毒

具有良好的细胞毒活性,可抑制B16黑色素瘤细胞 及HepG2人肝癌细胞的生长繁殖，其抑制作用具有

明显的浓度依赖关系，与蜜蜂蜂毒相似W 在大胡 蜂蜂毒中，由337个氨基酸组成的磷脂酶类似物 (magnifm)具有抑制血管生长活性「呵，癌细胞的迁

移和生长依赖新生血管的生成，此蛋白可能是抑制

细胞增殖的原因，同时，已有大量文献证明由26个

氨基酸组成的蜂毒肽(melittin)可使肿瘤细胞凋亡，

其可能是产生细胞毒性作用的关键因素，需进一步

研究。大胡蜂蜂毒中含有丰富的多肽和蛋白，是大

自然赋予我们的天然宝库，对蜂毒及其各种有效成 分进行药理学研究及抗肿瘤作用机制的研究是蜂毒

医药应用研究的努力方向。参考文献1

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