环境科学导－？ｌ】ｈｔｔｐ：／／ｈｊｋｘｄｋ．ｙｉｅｓ．ｏｒｇ．ｅｎ ２０１３，３２（２） ＣＮ５３—１２０５／Ｘ ＩＳＳＮ１６７３—９６５５ 淡水藻类的分离纯化方法探索 王梅梅，熊亚南，刘爱华，章广玲 （河北联合大学，河北唐山０６３０００） 摘 要：以唐山市水源水和终端水为实验材料，对淡水藻类的分离纯化方法进行了探索，大致分为以 下九种：培养基筛选法、稀释分离法、平板划线分离法、离心分离法、毛细管分离法、小滴分离法、ｐＨ 值分离法、温度分离法、抑制剂分离法。同时探索淡水藻类保藏方法。 关键词：藻类；分离纯化；方法 中图分类号：Ｘ８３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７３—９６５５（２０１３）Ｏ２一Ｏ１ｌ８—０４ １．１．３染液 近年来，对淡水藻与水体污染之间的关系的 研究有很大发展，不仅补充了水质化学分析的不 足，而且被广泛用于评价、监测和预报水质的情 况 。某些藻类在环境保护中作为水质监测的指 鲁哥氏碘液；中性红；梅氏苏木色素等。 １．２水样的采集和培养方法 １．２．１水样的采集方法 示生物，可以标志水体的污染程度 Ｊ。目前，国 内许多城市的供水水源多为湖泊或水库，随着工农 自来水水样：酒精灯灼烧水龙头５ｍｉｎ，放水 ５ｍｉｎ，取样时在水柱周围点燃用纱布缠绕的火圈， 形成局部无菌区，用已灭菌的三角瓶取样。 水厂水和水源水水样：用７５％酒精浸泡过的 塑料桶装样采集水厂水水样，采样后迅速运回实 验室。 业经济的发展，人类活动所产生的大量营养物质和 有毒物质排入水域，造成水库、湖？白的水体污染。 由于藻毒素的危害性比较大，目前对藻毒素的研究 越来越重视。研究藻类毒素首先要分离产毒藻种。 １材料与方法 １．２．２培养方法 １．１实验材料 １．１．１水样 液体培养：在三角瓶中培养，接种比例为Ｖ 培养基：Ｖ水样＝１：２。 固体培养：液体培养基中加入１．５％的琼脂， 培养皿中加入约１ｅｍ厚的培养基，加０．２ｍｌ藻液， 涂布。 （１）自来水水样 取样地点：河北联合大学。 取样时间：２０１１年３月～２０１２年３月。 （２）水源水水样 培养条件：（２８±１）℃、２４ｈ连续光照（２０００Ｌｕｘ） 取样地点：陡河水库。 取样时间：２０１１年３月～２０１２年３月。 １．１．２培养基 静置培养。 １．３藻类分离方法 １．３．１培养基筛选法 根据不同藻类对营养物、离子等需求不同而选 出不同的培养基，利用这些培养基对藻类进行初步 富集筛选。 ＨＧＺ培养基 Ｊ：用于大多数藻类的培养，蓝 藻生长最佳； 水生１０４号含氮培养基 中加入葡萄糖 （０．０５ｇ／Ｌ）：用于大多数藻类的培养； 自制的硅藻培养基：培养硅藻。配方：ｃａ （ＮＯ３）２ ０．０１ｇ，ＭｇＳＯ４ ０．０ｌｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ０．０１ｇ，Ｎａ－ 使用的培养基有：ＨＧＺ培养基，水生１０４号 含氮培养基＋葡萄糖，自制的硅藻培养基。 １．３．２稀释分离法 ’。 用５个无菌试管，在第一个试管中加入蒸馏水 １０ｍｌ，第２～５个试管中都加入５ｍｌ蒸馏水。在第 一ＳｉＯ３ ０．０２５ｇ，ＫＮＯ３ ０．０４ｇ，蒸馏水１０００ｍｌ。 个试管中加藻类混合液ｌ～２滴，充分振荡，使 收稿日期：２０１２—０８—２９ 基金项目：唐山市重点资助项目（１２１３０２１１Ａ）。 作者简介：王梅梅（１９８０一），女，衡水人。河北联合大学讲 其均匀稀释。然后用消毒移液管吸取第一个试管中 混有藻的液体５ｍｌ加入第二个试管中，如前振荡， 使其均匀稀释。以后依次同样加人第３～５试管， 师。主要研究方向：淡水藻类。 一１１８～ 淡水藻类的分离纯化方法探索 王梅梅 并都充分振荡，使其均匀稀释。然后分别镜检５个 试管，如在１滴中只发现２～３个同一藻类个体， 将这个试管作为原液，分别取１滴加到装有培养 基的小指管中。做大量的分离，将其放人光照培养 箱中培养。 蓝藻一般喜欢较高的温度，在夏季、秋季大量 生长。 将含有念珠藻和金藻的混合液放在水浴锅中， 在温度４２％中分别培养６ｈ，１２ｈ，１８ｈ，２４ｈ后， 取出放人光照培养箱中培养。 金藻在４２＂Ｃ时停止运动，念珠藻也受到一定 影响，但相对较小。 １．３．９抑制剂分离法 １．３．３平板划线分离法 在筛选出的培养基中加入２％的琼脂制成固体 培养基，倒平板。用接种环挑取一环培养液，在平 板上划线，光照培养，待长出藻群落后挑取藻体继 续划线，培养。在培养过程中镜检，直到在平板上 长出单个藻群落，镜检为单种藻类为止。该方法可 与稀释法结合应用。 １．３．４离心分离法 将培养液离心，不同种藻类虽都向离心管底部 下沉，但由于其大小各不相同而以不同的速率下 沉。因此，在离心的过程中，不同种的藻类可相互 分离。镜检，选择某种藻类含量最多的沉淀物，再 加入无菌水，继续离心，一直持续到可得到较纯的 藻体。 １．３．５毛细管分离法 主要工具是微细玻璃管。用微细玻璃管在 部加热后拉长６—１０ｃｍ，使口径缩小到０．００８～ ０．１６ｍｍ。拉长后的毛细管供吸取藻体用。在吸取 时，要利用一小段较厚的橡皮管，一端套在吸管 上，作为吸取藻体用。在压出藻体时，可直接利用 吸耳球吹出。将吸入的藻体吹进装有培养基的小指 管中进行培养。 １．３．６小滴分离法 用微量取液器进行操作，把与取液器配套使用 的尖包扎灭菌备用；将欲分离的样品制成均匀的 悬浮液并作适当稀释；用微量取液器吸取悬浮液， 在无菌的载玻片上以纵横成行的方式滴数个小液 滴，用显微镜镜检；当发现某一小滴内只有一种藻 体时，用另一无菌尖将此小滴移人已灭菌的培养 基内，经培养可能得到较纯的藻体。 １．３．７ ｐＨ值分离法 利用ＨＧＺ培养基适合多数藻类的生长这一特 性，将其ｐＨ值调到３，４，５，６，７，７．５，８， ８．５，９，将富集的藻类混合物接种到其中。在光照 培养箱中培养。这种方法可以分离那些对ｐＨ值要 求比较敏感的藻类。其中蓝藻多数适合生长在碱性 水体中。 １．３．８温度分离法 此法主要用于金藻和蓝藻的混合液。金藻对 温度变化敏感，喜低温，在早春、晚秋大量繁殖。 利用的主要药品有：制霉菌素、苯菌灵、多菌 灵等。 利用抑制剂对真核生物有作用而不影响原核生 物的特性来分离蓝藻。 经试验观察，制霉菌素效果较好。 １．４藻类保藏方法 １．４．１液体保藏 用于保藏的培养液浓度比正常的培养液浓度高 一倍。试管和三角瓶均可。 １．４．２斜面保藏 制备琼脂培养基时，营养液浓度也比正常的培 养液浓度高一倍，琼脂含量不宜过多，一般ｌ～ １．５％即可；斜面也不宜过大。用胶塞或棉塞依不 同藻类而定。 １．４．３固液双相保藏 在斜面保藏培养基中加人液体保藏培养基，液 体没过斜面为宜。该培养基的优点在于培养液不易 蒸发，可以较长时间保藏藻种。 １．４．４补充说明 应用以上三种培养基保藏时，在接种后均需先 放在适宜的光照与温度条件下，使藻种能够迅速增 殖。在藻体的生长达到最大程度前，要把其转移到 光线交暗、温度较低处。用纸遮盖，可防护棉塞不 沾灰尘并减少蒸发。保存期间要不断分养。每一藻 种的保存至少分三种不同年龄，最老的用于分养， 其余两种备用。如固体培养物变干，可加入液体培 养基继续培养。 ２讨论 ２．１分离纯化方法讨论 除已有的分离方法外，根据不同藻类的生理特 性，又自行设计并试验了多种方法，如温度分离 法、ｐＨ分离法、抑制剂分离法等，且效果较好， 结果见表１。 ＨＧＺ培养基适合多数藻类生长，蓝藻生长最 佳，例如念珠藻和席藻；水生１０４号含氮培养基＋ 葡萄糖适合大多数藻类的生长，如绿藻、金藻等； 一１ １９— 环境科学导刊ｈｔｔｐ：／／ｈｊｋｘｄｋ．ｙｉｅｓ．ｏｒｇ．ｅｎ第３２卷第２期２０１３年４月 自制的硅藻培养基适合舟形藻的生长。平板划线分 离法、毛细管分离法和小滴分离法均可与稀释法结 合使用。培养过程中念珠藻和金藻混杂在一起，可 用离心法进行分离，离心后念珠藻在下层，金藻在 上清液中，去上清，加无菌水继续离心，一直重复 至较纯，可用来分离单细胞的绿藻和金藻。ｐＨ分 离法可用来分离念珠藻和席藻。ＨＧＺ培养基的ｐＨ 调成碱性后，短时期内只有念珠藻和席藻可以良好 生长，这样就可把其他种的藻类去除掉。注意要及 时观察念珠藻和席藻的生长情况，时间过长，它们 也会死亡。温度分离法主要适用于金藻和念珠藻的 低温，对温度变化敏感。苯菌灵、多菌灵属于农药 类物质，对人体有害，并且它们对藻类的生长抑制 性不强，不易采用。制霉菌素相对比较安全，而且 对真核藻类的抑制效果比较明显，例如可以使金藻 细胞裂解，可以杀死栅藻。这样，对于金藻和蓝藻 或者栅藻和蓝藻的混合液中的蓝藻的分离就可在培 养液中加入制霉菌素，可以分离出蓝藻。通常加入 制霉菌素的量为０．３～０．４万单位／ｍｌ。 ２．２保藏方法讨论 由于需要长期存储，培养基要长时间供给藻体 营养，所以保藏用的培养基的营养成分浓度都要较 高，一般比正常培养基浓度高一倍。 混合液中的念珠藻的分离。念珠藻耐高温，金藻喜 表１ 不同分离方法的比较 表２几种藻种最佳保藏方法 栅藻在固体上生长细胞容易散落，分散成单 个细胞，而在液体中则长势良好；在液相中保藏的 纺锤藻由于生长过于旺盛，细胞形态变化很大，且 容易衰老，色素体消失；金藻在斜面或有固体的双 长，所以用液体保藏；蓝藻门的三种：念珠藻、席 藻都需要良好的通气条件，所以必须用棉塞（试 管）或纱布（三角瓶）。念珠藻在固体培养基上生 长，但是藻链变短，细胞变大，且生长缓慢；另外 相培养基中不能正常生长，鞭毛脱落，细胞膨大， 外观看变黄、粘稠，细胞死亡；舟形藻在自制的硅 两种在固体培养基上几乎不生长。念珠藻在纯液体 中生长太快，易衰老死亡，最长只能维持半个月时 藻培养基中生长最好，由于舟形藻具壳，比较硬， 间；而在三角瓶中的固液双相保藏效果最佳，可以 又有游动的性质，因此在固体培养基中几乎不生 一保藏数月。席藻在试管中用固液双相保藏效果最 １ ２０一 淡水藻类的分离纯化方法探索 王梅梅 好，而在三角瓶的液体培养基中，生长迅速，藻丝 养基的营养成分浓度都要较高，一般比正常培养基 聚集成团或者培养液变红，这都是衰老的标志。 浓度高一倍。念珠藻、席藻等蓝藻适宜用固液双相 保藏的藻种需要定期转接活化，除念珠藻需要 培养基保藏；舟形藻、月牙藻、栅藻、金藻适宜用 短期就进行转接，一般三个月转接一次；其余藻种 液体培养基保藏；另外保藏的藻种需要定期转接 可保藏较长时间，一年转接一次即可。 活化。 ３ 小结 参考文献： 本实验对唐山市水源水和终端水中藻类进行富 ［１］张经浩．论藻类植物的经济价值及其对人类的意义［Ｊ］．安 集培养、分离纯化。除已有的分离方法外，根据不 徽教育学院学报，２０００，１８（３）：７９—８１． ［２］房英春，苏宝玲．藻类与人类的关系［Ｊ］．特种经济动植物， 同藻类的生理特性，又自行设计并试验了多种方 ２００１，（１２）：２１． 法，如温度分离法、ｐＨ分离法、抑制剂分离法等， ［３］沈韫芬，顾曼如，施之心，等．微型生物监测新技术［Ｍ］． 且效果较好。蓝藻分离可以采用培养基初步筛选 北京：中国建筑工业出版社，１９９１：１４６—１４７． 法；平板划线分离法、毛细管分离法和小滴分离法 ［４］华汝成．单细胞藻类的培养与利用［Ｍ］．北京：农业出版社， 均可与稀释法结合使用，分离单细胞藻类，如绿 １９８６：２７２—３５６． 藻、金藻；温度分离法可以分离较耐高温的藻类， ［５］朱浩然．植物制片技术学［Ｍ］．北京：人民教育出版 社．１９６０． 抑制喜低温藻的生长，从而达到分离目的。 ［６］湛江水产学校．海洋饵料生物培养［Ｍ］．北京：农业出版 同时探索各藻种的最佳保藏方法，保藏用的培 社．１９８０． Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｇａｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｆｒｅｓｈ Ｗａｔｅｒ ＷＡＮＧ Ｍｅｉ—ｍｅｉ，ＸＩＯＮＧ Ｙａ－ｎａｎ，ＬＩＵ Ａｉ・ｈｕａ，ＺＨＡＮＧ Ｇｕａｎｇ－ｌｉｎｇ （Ｈｅｂｅｉ Ｕｎｉｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｎｇｓｈａｎ Ｈｅｂｅｉ ０６３０００ Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔａｋｉｎｇ ｔｈｅ ｓｏｕｒｃｅ ｗａｔｅｒ ａｎｄ ｅｎｄ—ｐｉｐｅ ｗａｔｅｒ ｉｎ Ｔａｎｇｓｈａｎ Ｍｕｎｉｃｉｐａｌｉｔｙ ａｓ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍａｔｅｒｉａｌｓ，ｗｅ ｄｉｓｃｕｓｓ ｔｈｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｌｇａｅ ｉｎ ｔｈｅ ｆｌｅｓｈ ｗａｔｅｒ．Ｔｈｅｒｅ ａｒｅ ａｂｏｕｔ ｎｉｎｅ ｍｅｔｈｏｄｓ，ｎａｍｅｌｙ ｓｕｂ— ｓｔｒａｔｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ，ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ，ｓｔｒｅａｋ ｐｌａｔｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ，ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ，ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｄｒｏｐ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｐＨ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｓｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ａｌｇａｅ ｉｓ ａｌｓｏ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｐｅｒ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ａｌｇａｅ；ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｍｅｔｈｏｄ
