万氏潜蝇姬小蜂孤雌产雌品系和两性品系的双重PCR检测方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 112522419 A(43)申请公布日 2021.03.19

(21)申请号 202011067344.6(22)申请日 2020.10.06

(71)申请人 中国农业科学院植物保护研究所

地址 100193 北京市海淀区圆明园西路2号(72)发明人 刘万学　杜素洁　叶福宇　郭建洋　

程鑫斐　潘立婷　万方浩　(74)专利代理机构 北京知本村知识产权代理事

务所(普通合伙) 11039

代理人 刘江良(51)Int.Cl.

C12Q 1/6888(2018.01)C12Q 1/686(2018.01)C12N 15/11(2006.01)

权利要求书1页 说明书9页序列表2页 附图2页

(54)发明名称

万氏潜蝇姬小蜂孤雌产雌品系和两性品系的双重PCR检测方法(57)摘要

本发明涉及万氏潜蝇姬小蜂两种品系快速PCR检测方法及所用的特异性COI引物。该方法根据万氏潜蝇姬小蜂两种品系线粒体DNA特异序列，通过特异性位点设计特异性引物，最终建立了一对万氏潜蝇姬小蜂的特异性检测COI引物。所述引物对包括引物DWAlgdCF：5’‑TTTGGTTTAATCTCTCAC‑3’；和DWlgdCR：5’‑ATGTAAAACAATATCAATTGAAGA‑3’。一步双重PCR引物为通用引物COISF、特异性引物DWAlgdCF和特异性引物DWlgdCR。成功建立的双重PCR体系能够对万氏潜蝇姬小蜂两性品系的卵、幼虫、蛹、雌成虫和雄成虫DNA，及两种品系在同一虫态下的混合DNA为模板亦有良好的检测效果。本方法是在难以从形态准确鉴定两种品系的背景下，能够快速有效的鉴定出其中一种品系，应用该方法，大大节约了时间和资金，并能获得可靠的结果。

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权　利　要　求　书

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1.用于检测万氏潜蝇姬小蜂孤雌产雌型和对应的两性品系两种品系的特异性SS‑COI引物，其特征在于，所述引物序列为：

 ‑3’，和DWAlgdCF：5’‑ TTTGGTTTAATCTCTCAC

DWlgdCR：5’‑ ATGTAAAACAATATCAATTGAAGA ‑3’。

2.一种通过双重PCR用于检测万氏潜蝇姬小蜂孤雌产雌型和对应的两性品系两种品系的引物组合，其特征在于：引物组合包括通用引物COISF、以及特异性引物DWAlgdCF和DWlgdCR；

其中各引物序列为：COISF引物简并序列：5’‑TAAGATTTGATTATT(AG)CC(TA)CC‑3’DWAlgdCF：5’‑ TTTGGTTTAATCTCTCAC ‑3’，和

5’‑ ATGTAAAACAATATCAATTGAAGA ‑3’。DWlgdCR：

3.一种利用双重PCR快速鉴定万氏潜蝇姬小蜂孤雌产雌型和对应的两性品系两种品系的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求2所述的引物组合对样本基因组进行PCR扩增的步骤，并对扩增产物进行检测的步骤，其中通过PCR扩增DNA样本，如有800bp扩增条带则为万氏潜蝇姬小蜂孤雌品系，如有354bp扩增条带则为万氏潜蝇姬小蜂两性品系。

4.一种用于鉴定万氏潜蝇姬小蜂的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求2所述的引物组合对样本基因组进行PCR扩增的步骤，并对扩增产物进行检测的步骤，其中通过PCR扩增DNA样本，如有800bp或354bp扩增条带则为万氏潜蝇姬小蜂，如果没有扩增条带则不是万氏潜蝇姬小蜂。

5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述PCR反应体系如下：按扩增体系为25 µL计，其中10×PCR Buffer （含Mg2+）2.5 µL、dNTPs（10 mM）1µL、COISF/ DWAlgdCF/ DWlgdCR的加量比例（10 µM）为0.5/0.5/1µL，、Taq聚合酶（2.5 U/µL）0.2µL、模板DNA 1.0µL、超纯水补至25 µL。

6.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述PCR反应程序如下： 95 ℃预变性5 min；35个循环（94 ℃ 30 sec，52 ℃ 30 sec，72 ℃ 45 sec）；最后72 ℃ 延伸7 min。

7.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述对扩增产物进行检测的步骤是琼脂糖凝胶电泳。

8.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述样本是寄生峰的卵、幼虫、蛹、或雌成虫。

9.一种试剂盒，其特征于，包括如权利要求2所述的引物组合，以及提取样本基因组的试剂，所述试剂盒用于快速鉴定万氏潜蝇姬小蜂孤雌产雌型和对应的两性品系两种品系，或者用于样本是否是万氏潜蝇姬小蜂。

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万氏潜蝇姬小蜂孤雌产雌品系和两性品系的双重PCR检测

方法

技术领域

[0001]本发明涉及昆虫分子生物学鉴定领域，具体涉及万氏潜蝇姬小蜂两种品系的双重PCR特异性检测技术。

技术背景

[0002]2015年7月，我们在青海省西宁市的露天种植的豌豆上发现豌豆彩潜蝇上的一种优势寄生蜂，经过传统形态分类学和分子鉴定方法比较，确定其为新种并命名为万氏潜蝇姬小蜂Diglyphus wani，并且验证了该蜂具有孤雌产雌特性(Female‑producing parthenogenesis)和3种寄主致死(host‑killing)行为：寄生(parasitism)致死、寄主取食

 feeding)致死、直接叮蛰致死(host stinging)(Ye et al.,2018)。田间调查结果显(host示，该蜂的寄主种类包括三叶草斑潜蝇Liriomyza trifolii、美洲斑潜蝇L.sativae、南美斑潜蝇L.huidobrensis、番茄斑潜蝇L.bryoniae、豌豆彩潜蝇Chromatomyia horticola和葱斑潜蝇L.chinensis等，而这些潜叶蝇是我国重要的蔬菜和花卉上的害虫，尤其是4种外来斑潜蝇(前4种)的入侵严重威胁着我国农产品的正常生产与国际贸易或运输(Chen X X.,Lang F Y.,Xu Z H.,et al.The occurrence of leafminers and their parasitoids on vegetables and weeds in Hangzhou area,Southeast China.Biological Control,2003,48(5):515‑527.；Kang L.,Chen B.,Wei J N.,et al.Roles of Thermal adaptation and chemical ecology in Liriomyza distribution and control.Annual Review of Entomology,2009,54(1):127‑145.；刘万学,王文霞,王伟,等.潜蝇姬小蜂属寄生蜂对潜叶蝇的控害特性及应用.昆虫学报,2013(4):427‑437.；Cheng X Q.,Cao F Q.,Zhang Y B.,et al.Life history and life table of the host‑feeding parasitoid Hemiptarsenus varicornis(Hymenoptera:Eulophidae).Applied Entomology and Zoology,2017,52(2):287‑293.；Gao Y.,Reitz S.,Xing Z.,et al.A decade of a leafminer invasion in China:lessons learned.Pest Management Science,2017,73(9):1775‑1779.；Ye F Y.,Zhu C D.,Yefremova Z.,et al.Life history and biocontrol potential of the first female‑producing parthenogenetic species of Diglyphus(Hymenoptera:Eulophidae)against agromyzid leafminers.Scientific Reports,2018,8(1):3222.)。[0003]2017年，我们在云南省昆明市发现了与D.wani形态极为相似的一种两性生殖型寄生蜂，经分类专家Zoya Yefremova鉴定，该蜂为孤雌品系对应的两性品系，而非新种。据我们调查，这两种品系是田间蔬菜潜叶蝇上的优势寄生蜂种类，以及具有三种寄主致死行为：产卵致死、叮蛰致死和取食致死。另外，孤雌产雌型寄生蜂由于无需交配即可产生雌性后代，因此相比两性生殖的寄生蜂，在其饲养和防控上可减半地节约成本并能在寄主低密度环境快速建立种群它的应用将可能成为重要的生防作用物。

[0004]万氏潜蝇姬小蜂两种品系间在形态上有着极显微的差异，快速鉴定难度很大。一

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方面品系间的细微形态差异易受外界环境变化发生改变，导致鉴定过程中与原先鉴定的表型难以相符。另一方面，由于寄生蜂成虫个体小，很多关键形态特征难以简单地通过显微镜辨别两种品系。因此，对于非专业分类学者来说，从形态上区分个体较小的万氏潜蝇姬小蜂不同品系，是非常困难的。发明内容

[0005]因为万氏潜蝇姬小蜂两个品系形态相似，目前确定为哪一种品系时需要结合形态与分子的结果，其过程费工费时。本发明建立了一种快速、准确、特异性的分辨孤雌产雌品系和两性品系的双重PCR检测引物和体系。[0006]在研究过程，前期我们也尝试过利用线粒体基因标记(COI基因)和核基因标记(ITS1、ITS2和28S)来区分万氏潜蝇姬小蜂两种品系。结果发现COI基因具有较多的变异位点，可以较好地区分这两种品系，而ITS1和ITS2次之。但是，发现该方法仍然存在不足之处，需要通过测序、数据库比对分析才能最终确定是否为万氏潜蝇姬小蜂孤雌品系或者两性品系，鉴定过程耗时费力。为了准确判断万氏潜蝇姬小蜂不同品系，需要建立一套快速准确的分子检测方法。因而，本发明研发了基于mtDNA COI基因的一步双重PCR快速分子识别的检测方法，利用设计并筛选得到的特异性引物进行PCR扩增，根据预期DNA条带的有无来判断检测结果，无需测序和序列比对，具有特异性强、灵敏度高、重现性好且稳定、快速、简便等优点。

[0007]本发明利用通用引物COISF(5’ Z L.,‑TAAGATTTGATTATT(AG)CC(TA)CC‑3’)(ShaZhu C D.,Murphy R W.,et al.Mitochondrial phylogeography of a leafminer parasitoid,Diglyphus isaea(Hymenoptera:Eulophidae)in China.Biological Control,2006,38(3):0‑3.)和COI2613(5'‑ATTGCAAATACTGCACCTAT‑3')(Chen Y.,Xiao H.,Fu J.,et al.A molecular phylogeny of eurytomid wasps inferred from DNA sequence data of 28S,18S,16S rRNA,and COI genes.Molecular Phylogenetics and Evolution,2004,31(1):300‑307.[0008])扩增线粒体片段，片段大小约为900bp。然后，利用Mega 7.0软件(Kumar S.,Stecher G.,Tamura K.MEGA7:molecular evolutionary genetics analysis version 7.0for bigger datasets.Molecular Biology and Evolution,2016,33(7):1870‑1874.)比对多个群体的COI基因序列。根据万氏潜蝇姬小蜂孤雌品系和两性品系COI基因序列的差异，采用Primer Premier 5.0软件设计双重PCR引物，分析其G+C含量、二级结构、错配、自由能等参数，最终筛选到一条两性品系特异性正向引物DWAlgdCF，一条针对两种品系的特异性下游引物DWlgdCR。最后，用于一步双重PCR的引物为COISF(通用引物)、特异性引物DWAlgdCF和DWlgdCR，并将引物送至北京擎科生物科技有限公司合成。[0009]因此，本发明提供一种用于检测万氏潜蝇姬小蜂孤雌产雌型和对应的两性品系两

其特征在于，所述引物序列为：种品系的特异性SS‑COI引物，

[0010]DWAlgdCF：5’‑TTTGGTTTAATCTCTCAC‑3’，和[0011]DWlgdCR：5’‑ATGTAAAACAATATCAATTGAAGA‑3’。

[0012]进而本发明提供一种通过双重PCR用于检测万氏潜蝇姬小蜂孤雌产雌型和对应的两性品系两种品系的引物组合，其包括通用引物COISF、以及DWAlgdCF和DWlgdCR；其中各引

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物序列为：

[0013]COISF简并引物：5’‑TAAGATTTGATTATT(AG)CC(TA)CC‑3’[0014]DWAlgdCF：5’‑TTTGGTTTAATCTCTCAC‑3’，和[0015]DWlgdCR：5’‑ATGTAAAACAATATCAATTGAAGA‑3’。[0016]同时，本发明提供一种利用双重PCR快速鉴定万氏潜蝇姬小蜂孤雌产雌型和对应的两性品系两种品系的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求2所述的引物组合对样本基因组进行PCR扩增的步骤，并对扩增产物进行检测的步骤，其中通过PCR扩增DNA样本，如有800bp扩增条带则为万氏潜蝇姬小蜂孤雌品系，如有354bp扩增条带则为万氏潜蝇姬小蜂两性品系。

[0017]本发明进一步提供一种用于鉴定万氏潜蝇姬小蜂的方法，其包括使用上述的引物组合对样本基因组进行PCR扩增的步骤，并对扩增产物进行检测的步骤，其中通过PCR扩增DNA样本，如有800bp或354bp扩增条带则为万氏潜蝇姬小蜂，如果没有扩增条带则不是万氏潜蝇姬小蜂。

[0018]优选地，所述PCR反应体系如下：按扩增体系为25μL计，其中10×PCR Buffer(含Mg2+)2.5μL、dNTPs(10mM)1μL、COISF/DWAlgdCF/DWlgdCR的加量比例(10μM)为0.5/0.5/1μL，、Taq聚合酶(2.5U/μL)0.2μL、模板DNA1.0μL、超纯水补至25μL。[0019]优选地， 30sec，52℃ 所述PCR反应程序如下：95℃预变性5min；35个循环(94℃30sec，72℃ 45sec)；最后72℃延伸7min。[0020]在具体实施方式中，所述对扩增产物进行检测的步骤是琼脂糖凝胶电泳。所述样本是寄生峰的卵、幼虫、蛹、或雌成虫。[0021]此外，本发明还提供一种试剂盒，其包括如上述的引物组合，以及提取样本基因组的试剂，所述试剂盒用于快速鉴定万氏潜蝇姬小蜂孤雌产雌型和对应的两性品系两种品系，或者用于样本是否是万氏潜蝇姬小蜂。

[0022]本发明以万氏潜蝇姬小蜂两种品系为材料，采用聚合酶链式反应(PCR)技术，以线粒体通用引物COISF和COI2613扩增长片段后，根据品系间的特异性位点，设计并筛选特异性引物。最后分别成功设计出了针对孤雌品系和两性品系的品系特异性上游引物，以及针对这两种品系的特异性下游引物。通过一步多重PCR检测程序，孤雌品系可扩增出800bp，两性品系可扩增出354bp，而同一生境内的其他寄生蜂种类并没有电泳条带，说明本发明设计并使用的特异性引物是切实可行的。该发明为万氏潜蝇姬小蜂两种品系的快速分子识别给非专业分类学者提供巨大的便利，也为我国潜叶蝇类害虫尤其入侵性斑潜蝇的生物防控提供辅助手段。

附图说明

[0023]图1：以线粒体通用引物COISF和COI2613的扩增结果[0024]注：M：分子量标准Trans 2KTM，条带大小分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、200bp和100bp；1‑7分别为小斑潜蝇姬小蜂Diglyphus minoeus、底比斯姬小蜂Ocharis pentheus、圆形赘须金小蜂Halticoptera circulus、豌豆潜蝇姬小蜂Diglyphus isaea、芙新姬小蜂Neochrysocharis formosa两性品系、芙新姬小蜂Neochrysocharis formosa孤雌品系、大斑潜蝇姬小蜂Diglyphus crassinervis；8‑11为万氏潜蝇姬小蜂Diglyphus wani

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孤雌品系的卵、幼虫、蛹、雌成虫；12‑16为万氏潜蝇姬小蜂Diglyphus wani两性品系的卵、幼虫、蛹、雌成虫、雄成虫。[0025]图2：万氏潜蝇姬小蜂的特异性引物浓度配比条件优化[0026]注：分子量标准Trans 2KTM，条带大小分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、200bp和100bp；1‑11为COISF/DWAlgdCF/DWlgdCR加量比例：0/1/1、0.1/0.9/1、0.2/0.8/1、0.3/0.7/1、0.4/0.6/1、0.5/0.5/1、0.6/0.4/1、0.7/0.3/1、0.8/0.2/1、0.9/0.1/1、1/0/1μL，DNA模板为万氏潜蝇姬小蜂Diglyphus wani孤雌品系；12‑22为COISF/DWAlgdCF/DWlgdCR加量比例：0/1/1、0.1/0.9/1、0.2/0.8/1、.0.3/0.7/1、0.4/0.6/1、0.5/0.5/1、0.6/0.4/1、0.7/0.3/1、0.8/0.2/1、0.9/0.1/1、1/0/1μL，DNA模板为万氏潜蝇姬小蜂Diglyphus wani两性品系；23：阴性对照(超纯水)。[0027]图3：万氏潜蝇姬小蜂的特异性引物退火温度条件优化[0028]注：分子量标准Trans 2KTM，条带大小分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、200bp和100bp；1‑10为DNA模板为万氏潜蝇姬小蜂Diglyphus wani孤雌品系，退火温度依次为44、46、48、50、52、54、56、58、62、℃；12‑21为DNA模板为万氏潜蝇姬小蜂两性品系D.wani(Ar)，退火温度依次为44、46、48、50、52、54、56、58、62、℃；11和22：阴性对照(超纯水)。[0029]图4：特异性引物对万氏潜蝇姬小蜂两种品系不同虫态PCR扩增结果[0030]注：M表示2K Marker，条带大小分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、200bp和100bp；1‑4为万氏潜蝇姬小蜂孤雌品系D.wani(Th)的卵、幼虫、蛹、雌成虫；5‑9为万氏潜蝇姬小蜂两性品系D.wani(Ar)的卵、幼虫、蛹、雌成虫、雄成虫；10‑14为万氏潜蝇姬小蜂两种品系D.wani的混合卵DNA、混合幼虫DNA、混合蛹DNA、孤雌品系雌虫和两性品系雌虫混合DNA、孤雌品系雌虫和两性品系雄虫混合DNA。[0031]图5：设计的特异性引物在两种品系及同一生境下获得的寄生蜂中的扩增效果：[0032]注：M：分子量标准Trans 2KTM，条带大小分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、200bp和100bp；1‑9分别为圆形赘须金小蜂Halticoptera circulus、底比斯姬小蜂Ocharis pentheus、小斑潜蝇姬小蜂Diglyphus.minoeus、大斑潜蝇姬小蜂Diglyphus.crassinervis、豌豆潜蝇姬小蜂Diglyphus.isaea、芙新姬小蜂Neochrysocharis formosa两性品系、芙新姬小蜂Neochrysocharis formosa孤雌品系、万氏潜蝇姬小蜂Diglyphus wani孤雌品系和万氏潜蝇姬小蜂Diglyphus wani两性品系，10：阴性对照(超纯水)。[0033]图6：万氏潜蝇姬小蜂的特异性引物的灵敏度[0034]注：M表示2K Marker，条带大小分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、200bp和100bp；1‑9分别为将模板稀释至2‑1、2‑2、2‑3、2‑4、2‑5、2‑6、2‑7、2‑8和2‑9倍，DNA模板为万氏潜蝇姬小蜂孤雌品系D.wani；10‑18分别为将模板稀释至2‑1、2‑2、2‑3、2‑4、2‑5、2‑6、、2‑7、2‑8和2‑9倍，DNA模板为万氏潜蝇姬小蜂两性品系D.wani；19为阴性对照。[0035]图7：双重PCR引物在不同地理种群上的检测[0036]注：M表示2K Marker，条带大小分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、200bp和100bp；A和B均为不同地理区域的万氏潜蝇姬小蜂的双重PCR扩增。A：1‑5采自自治区拉萨市，6‑10采自青海省西宁市，11‑14采自河北省石家庄市，15‑18采自黑龙江省齐齐哈尔市，19‑22采自自治区吐鲁番市；B：1‑8采自云南省昆明市，9‑15采自贵州省贵阳市，16‑

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20采自四川省西昌市。

具体实施方式

[0037]实施例1：线粒体通用引物COISF和COI2613扩增寄生蜂的结果[0038]1)线粒体通用引物COISF和COI2613[0039]以线粒体基因为靶标序列，通用引物序列为：[0040]COISF：5'‑TAAGATTTGATTATT(AG)CC(TA)CC‑3'(SEQ ID No:1)和[0041]COI2613：5'‑ATTGCAAATACTGCACCTAT‑3'(SEQ ID No:2)。[0042]引物由北京擎科生物科技有限公司合成。[0043]2)基因组的提取

[0044]基因组DNA提取方法：盐析法。具体步骤：[0045](1)将单头虫源放进200μL PCR管底，用打火机或酒精灯烧熔头尖端，之后用头使劲几次按压研磨虫源至碎末状，之后用150μL裂解液(50mmol/L Tris‑Cl，pH7.5，400mmol/L NaCl，20mmol/L EDTA，0.5％SDS)冲洗头两次；[0046](2)加入5μL蛋白酶K(20mg/mL)，轻摇混匀，60℃水浴1h或更久一些(中间取出摇动混匀1次)；[0047]μL 5M NaCl，用力摇动使其混匀，4℃14000rpm离心10min，将蛋白质沉(3)加入80淀，移上清液到另一离心管中；[0048]μL预冷的无水乙醇，轻轻混匀，‑20℃放置30min或更久一些；(4)加入440[0049](5)4℃14000rpm离心12min，弃上清液；加入440μL预冷的75％乙醇洗涤，4℃14000rpm离心10min，弃上清液；[0050](6)在室温下或37度烘箱内干燥，之后30μL ddH2O溶解，并检测模板的浓度，标注于管壁，最后‑20℃保存待用。

[0051]3)PCR扩增反应体系及程序[0052]扩增体系为25μL，其中10×PCR Buffer 2.5μL(含Mg2+)、dNTPs(10mM)0.4μL、COISF和COI2613(10μM)各为0.4μL，Taq聚合酶(2.5U/μL)0.2μL、模板DNA 1.0μL、超纯水补至25μL。扩增程序：95℃预变性5min；35个循环(94℃ 30sec，48℃ 30sec，72℃ 45sec)；最后72℃延伸7min。

[0053]4)琼脂糖凝胶电泳检测[0054]取3‑5μL PCR产物用含有Gold view的1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，后于凝胶成像系统查看电泳结果。

[0055]实施结果:利用线粒体通用引物COISF和COI2613，可在万氏潜蝇姬小蜂两种品系的不同虫态下、小斑潜蝇姬小蜂、底比斯姬小蜂、圆形赘须金小蜂、豌豆潜蝇姬小蜂、芙新姬小蜂两性品系、芙新姬小蜂孤雌品系、大斑潜蝇姬小蜂等寄生蜂以上成功扩增出约900bp的基因片段(图1)，即这些寄生蜂的基因组模板提取效果较好，可用于下一步实验。[0056]实施例2：针对万氏潜蝇姬小蜂两种品系的特异性引物的设计与反应条件优化[0057]1)万氏潜蝇姬小蜂两种品系的特异性引物的设计和合成[0058]以万氏潜蝇姬小蜂两种品系线粒体基因为靶标序列，比对品系间、其他寄生蜂种类和寄主之间的序列差异，根据特异性差异位点，采用primer primer 5.0软件设计引物，

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其序列为：

[0059]DWAlgdCF：5’‑TTTGGTTTAATCTCTCAC‑3’(SEQ ID No:3)[0060]DWlgdCR：5’‑ATGTAAAACAATATCAATTGAAGA‑3’(SEQ ID No:4)。[0061]通用引用采用引物COISF：5’‑TAAGATTTGATTATTGCCTCC‑3’。[0062]引物由北京擎科生物科技有限公司合成。[0063]其中，特异性扩增万氏潜蝇姬小蜂孤雌品系800bp片段的序列(SEQ ID No:5)：引物区段如下划线标记处

[00]TAAGATTTTGATTATTGCCTCCAAGATTAATGTTATTAATTTCTAGGATGTTTATTGGTACTGGGACAGGTACGGGGTGGACTGTTTATCCTCCTTTATCTTCAAATTTAGGTCATAGAGGGCCTTCAGTAGATTTATCAATTTTTTCTTTACATATTGCTGGTGCATCTTCGATTATAGGTTCAATTAATTTTATTAGAACTATTATTAATATAAAAAATTATAAAGTTGAAAATATTTCTTTATTTTCTTGGGCTATATTATTAACAGCAATTTTATTATTATTATCTCTTCCAGTATTAGCAGGGGCAATTACAATATTATTATTTGATCGAAATTTAAATACTTCTTTTTTTGATCCTTCAGGGGGAGGGGACCCAATTTTATATCAACATTTATTTTGATTTTTTGGTCATCCTGAGGTGTATATTTTAATTCTTCCTGGTTTTGGTTTAATTTCTCATATAATTTGTAATGAAAGATTGAAGAAAGAAGTATTTGGTTCAATAGGAATAATTTACGCAATAATTTCTATTGGATTATTAGGTTTTATTGTTTGAGCTCATCATATGTTTACAGTAGGAATAGATGTAGACACTCGTGCTTATTTTACGTCTGCAACTATAATTATTGCTATCCCCACTGGGATTAAGATTTTTAGATGATTAGCATCAATAAATGGGATAAAAATTAAATTTACAGTTTCAAATTTATGGTTATTAGGGTTTATTTTTTTATTTACTGTCGGGGGTTTAACAGGAATTATTTTATCTAACTCTTCAATTGATATTGTTTTACAT。

[0065]特异性扩增万氏潜蝇姬小蜂两性品系354bp片段的序列(SEQ ID No:6)：引物区段如下划线标记处

[0066]TTTGGTTTAATCTCTCACATAATTTGTAATGAAAGATTAAAAAAAGAAGTATTTGGTTCTATAGGAATAATTTATGCCATAATTTCTATTGGATTACTAGGTTTTATTGTTTGGGCTCATCACATGTTTACAGTAGGAATAGATGTAGATACTCGTGCCTATTTTACGTCTGCAACTATAATTATTGCTATTCCCACTGGGATTAAGATTTTTAGGTGATTAGCATCAATAAATGGAATAAAAATTAAATTTACAGTTTCAAATCTATGGTTATTAGGGTTTATTTTTTTATTTACTGTTGGGGGTTTAACCGGAATTATTTTATCTAATTCTTCAATTGATATTGTTTTACAT。[0067]2)万氏潜蝇姬小蜂两种品系基因组的提取

[0068]基因组DNA提取方法的具体步骤参见实施例1中的方法。[0069]3)PCR扩增反应体系及程序

[0070]为确定引物对的最佳扩增条件和最佳反应程序，我们依次设置引物对加量比例、引物对退火温度等多组处理。

[0071]不同引物配比条件的优化：在25μL反应体系中，分别以万氏潜蝇姬小蜂两性品系和孤雌品系为DNA模板，分别设置不同比例的引物组合，即10μmol·L‑1引物COISF/DWAlgdCF/DWlgdCR的加量比例分别为：0/1/1、0.1/0.9/1、0.2/0.8/1、.0.3/0.7/1、0.4/0.6/1、0.5/0.5/1、0.6/0.4/1、0.7/0.3/1、0.8/0.2/1、0.9/0.1/1、1/0/1μL，2.5mmol·mL‑1

dNTPs 1μL，10×PCR Buffer 2.5μL，Taq DNA聚合酶0.2μL，ddH2O补足至25μL。扩增条件：95℃3min；94℃30sec，52℃45sec，72℃45sec，34个循环；72℃延伸5min。[0072]引物对退火温度优化：分别以万氏潜蝇姬小蜂两性品系、万氏潜蝇姬小蜂孤雌品系为模板，退火温度梯度为44、46、48、50、52、54、56、58、60、62℃。反应体系：DNA模板1μL，10μmol·L‑1引物COISF和DWAlgdCF各0.5μL，DWlgdCR 1μL，2.5mmol·mL‑1dNTPs1μL，10×PCR 

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Buffer 2.5μL，Taq DNA聚合酶0.2μL，ddH2O补足至25μL。扩增条件：95℃ 3min；94℃ 30sec，44‑62℃ 45sec，72℃ 45sec，34个循环；72℃延伸5min。[0073]4)琼脂糖凝胶电泳检测[0074]取3‑5μL PCR产物用含有Gold view的1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，后于凝胶成像系统查看电泳结果，根据扩增的条带确定引物对的最佳反应条件。[0075]实施结果:以万氏潜蝇姬小蜂两种品系为模板DNA，对各引物组合分别设置加量比例和退火温度梯度的PCR扩增，进而以确定各引物对的最佳扩增条件。通过设置引物COISF/DWAlgdCF/DWlgdCR加量比例为0.5/0.5/1，在万氏潜蝇姬小蜂孤雌品系和两性品系中均能扩增出明亮的条带，条带大小分别为800bp和354bp(图2)；通过设置引物退火温度梯度为52℃时扩增得到条带最亮(图3)。因此，应以引物COISF/DWAlgdCF/DWlgdCR加量比例为0.5/0.5/1和52℃退火温度进行下一步验证实验。[0076]实施例3：特异性引物在万氏潜蝇姬小蜂两种品系不同虫态下和同一生境下其他寄生蜂上的检测

[0077]本实施例对万氏潜蝇姬小蜂两种品系不同虫态、以及小斑潜蝇姬小蜂、底比斯姬小蜂、圆形赘须金小蜂、豌豆潜蝇姬小蜂、芙新姬小蜂两性品系、芙新姬小蜂孤雌品系、大斑潜蝇姬小蜂等寄生蜂进行PCR扩增。

[0078]1)万氏潜蝇姬小蜂两种品系的特异性引物[0079]采用实施例2中的引物。

[0080]2)万氏潜蝇姬小蜂两种品系与其他寄生蜂基因组的提取[0081]基因组DNA提取方法具体步骤参见实施例1中的方法。[0082]3)PCR扩增反应体系及程序[0083]扩增体系为25μL，其中10×PCR Buffer(含Mg2+)2.5μL、dNTPs(10mM)1μL、COISF/DWAlgdCF/DWlgdCR的加量比例(10μM)为0.5/0.5/1μL，、Taq聚合酶(2.5U/μL)0.2μL、模板DNA 1.0μL、超纯水补至25μL。[0084]扩增程序：95℃预变性5min；35个循环(94℃ 30sec，52℃ 30sec，72℃ 45sec)；最后72℃延伸7min。

[0085]4)琼脂糖凝胶电泳检测[0086]取3‑5μL PCR产物用含有Gold view的1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，后于凝胶成像系统查看电泳结果，根据扩增的条带确定引物对的最佳反应条件。[0087]实施结果:利用引物COISF/DWAlgdCF/DWlgdCR，对万氏潜蝇姬小蜂两种品系不同虫态、小斑潜蝇姬小蜂、底比斯姬小蜂、圆形赘须金小蜂、豌豆潜蝇姬小蜂、芙新姬小蜂两性品系、芙新姬小蜂孤雌品系、大斑潜蝇姬小蜂等寄生蜂进行PCR扩增。引物COISF/DWAlgdCF/DWlgdCR能够特异性识别不同虫态下的万氏潜蝇姬小蜂两种品系，并且可以在混合模板中检测到万氏潜蝇姬小蜂两种品系(图4)。在其他7种寄生蜂以及阴性对照中均无目的扩增产物，在8泳道和9泳道的万氏潜蝇姬小蜂中可扩增出800bp(孤雌品系)和354bp(两性品系)的目的条带(图5)。该结果说明引物COISF/DWAlgdCF/DWlgdCR特异性较好，可特异性检测万氏潜蝇姬小蜂两种品系。[0088]实施例4：引物组合COISF/DWAlgdCF/DWlgdCR对万氏潜蝇姬小蜂两种品系检测阈值的测定

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1)基因组DNA提取方法：具体步骤参见实施例1。

[0090]2)PCR扩增反应体系及程序[0091]从提取好的万氏两种品系的30μL模板中，各取1μL，进行两倍梯度分别稀释至2‑1、2‑2、2‑3、2‑4、2‑5、2‑6、、2‑7、2‑8和2‑9倍。反应体系：DNA模板1μL，10μmol·L‑1引物COISF/DWAlgdCF/DWlgdCR(10μM)加量为0.5/0.5/1μL，2.5mmol·mL‑1dNTPs 1μL，10×PCR Buffer 2.5μL，Taq DNA聚合酶0.2μL，ddH2O补足至25μL。[0092]扩增程序：95℃预变性5min；35个循环(94℃ 30sec，52℃ 30sec，72℃ 45sec)；最后72℃延伸7min。

[0093]3)琼脂糖凝胶电泳检测[0094]取3‑5μL PCR产物用含有Gold view的1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，后于凝胶成像系统查看电泳结果，根据扩增的条带确定引物对的最佳反应条件。

[0095]实施结果:万氏潜蝇姬小蜂孤雌品系DNA模板的初始浓度为23.1ng·μL‑1(A260/A280＝2.067，A260/A230＝1.824)，两性品系DNA模板的初始浓度为26.8ng·μL‑1(A260/A280＝2.053，A260/A230＝1.114)，当DNA模板以两倍梯度分别逐步稀释至2‑1、2‑2、2‑3、2‑4、2‑5、2‑6、2‑7、2‑8和2‑9倍时，特异性引物的灵敏度逐渐下降，在稀释至2‑7倍时，目的条带消失(图6)，表明双重PCR对万氏潜蝇姬小蜂孤雌品系和两性品系的检测灵敏度分别为：0.181ng·μL‑1和0.205ng·μL‑1。[0096]实施例5：不同地理区域万氏潜蝇姬小蜂的双重PCR检测[0097]1)虫源采集。信息如表2所示。

[0098]表2不同地理区域万氏潜蝇姬小蜂两种品系的采集信息

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注：Ar表示万氏潜蝇姬小蜂两性品系；Th表示万氏潜蝇姬小蜂孤雌品系。

[0101]2)基因组DNA提取方法：参见实施例1中的方法。[0102]3)PCR扩增反应体系及程序[0103]反应体系：DNA模板1μL，10μmol·L‑1引物COISF/DWAlgdCF/DWlgdCR(10μM)加量为0.5/0.5/1μL，2.5mmol·mL‑1dNTPs 1μL，10×PCR Buffer 2.5μL，Taq DNA聚合酶0.2μL，ddH2O补足至25μL。[0104]扩增程序：95℃预变性5min；35个循环(94℃ 30sec，52℃ 30sec，72℃ 45sec)；最后72℃延伸7min。

[0105]4)琼脂糖凝胶电泳检测[0106]取3‑5μL PCR产物用含有Gold view的1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，后于凝胶成像系统查看电泳结果，根据扩增的条带确定引物对的最佳反应条件。[0107]实施结果：利用优化的双重PCR体系检测8个不同地理区域的万氏潜蝇姬小蜂，结果显示，采集自自治区拉萨市、青海省西宁市、河北省石家庄市、黑龙江省齐齐哈尔市和自治区吐鲁番市的万氏潜蝇姬小蜂均为孤雌品系，有明亮电泳条带(800bp)；采自云南省昆明市、贵州省贵阳市和四川省西昌市的万氏潜蝇姬小蜂为两性品系，有明亮电泳条带(354bp)(图7)。

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序　列　表

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<110>中国农业科学院植物保护研究所

<120>万氏潜蝇姬小蜂孤雌产雌品系和两性品系的双重PCR检测方法<160> 6<210> 1<211>23<212> DNA<400> 1

TAAGATTTGATTATT(AG)CC(TA)CC<210> 2<211>20<212> DNA<400> 2

ATTGCAAATACTGCACCTAT<210> 3<211>18<212> DNA<400> 3

TTTGGTTTAATCTCTCAC<210> 4<211>24<212> DNA<400> 4

ATGTAAAACAATATCAATTGAAGA<210> 5<211>800<212> DNA<400> 5

TAAGATTTTGATTATTGCCTCCAAGATTAATGTTATTAATTTCTAGGATGTTTATTGGTACTGGGACAGGTACGGGGTGGACTGTTTATCCTCCTTTATCTTCAAATTTAGGTCATAGAGGGCCTTCAGTAGATTTATCAATTTTTTCTTTACATATTGCTGGTGCATCTTCGATTATAGGTTCAATTAATTTTATTAGAACTATTATTAATATAAAAAATTATAAAGTTGAAAATATTTCTTTATTTTCTTGGGCTATATTATTAACAGCAATTTTATTATTATTATCTCTTCCAGTATTAGCAGGGGCAATTACAATATTATTATTTGATCGAAATTTAAATACTTCTTTTTTTGATCCTTCAGGGGGAGGGGACCCAATTTTATATCAACATTTATTTTGATTTTTTGGTCATCCTGAGGTGTATATTTTAATTCTTCCTGGTTTTGGTTTAATTTCTCATATAATTTGTAATGAAAGATTGAAGAAAGAAGTATTTGGTTCAATAGGAATAATTTACGCAATAATTTCTATTGGATTATTAGGTTTTATTGTTTGAGCTCATCATATGTTTACAGTAGGAATAGATGTAGACACTCGTGCTTATTTTACGTCTGCAACTATAATTATTGCTATCCCCACTGGGATTAAGATTTTTAGATGATTAGCATCAATAAATGGGATAAAAATTAAATTTACAGTTTCAAATTTATGGTTATTAGGGTTTATTTTTTTATTTACTGTCGGGGGTTTAACAGGAATTATTTTATCTAACTCTTCAATTGATATTGTTTTACAT

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序　列　表

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<210> 6<211>354<212> DNA<400> 6

TTTGGTTTAATCTCTCACATAATTTGTAATGAAAGATTAAAAAAAGAAGTATTTGGTTCTATAGGAATAATTTATGCCATAATTTCTATTGGATTACTAGGTTTTATTGTTTGGGCTCATCACATGTTTACAGTAGGAATAGATGTAGATACTCGTGCCTATTTTACGTCTGCAACTATAATTATTGCTATTCCCACTGGGATTAAGATTTTTAGGTGATTAGCATCAATAAATGGAATAAAAATTAAATTTACAGTTTCAAATCTATGGTTATTAGGGTTTATTTTTTTATTTACTGTTGGGGGTTTAACCGGAATTATTTTATCTAATTCTTCAATTGATATTGTTTTACAT

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说　明　书　附　图

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图1

图2

图3

图4

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说　明　书　附　图

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图5

图6

图7

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