DNA回收纯化及重组体的构建实验补充材料
本实验是将具有HindIII和BamH I粘性末端的基因片段以及载体通过DNA连接酶连接起来。主要过程包括：
PCR产物的纯化 PCR产物以及空载体的酶切
乙醇沉淀 电泳检测 连接 160C过夜
直接从PCR产物回收纯化DNA (Promega 公司试剂盒):
1) 直接加90-100μl纯化缓冲液于1.5ml离心管，再加入30～300μl PCR反应物，Vortex混合； 2) 加入1ml树脂轻轻Vortex 3次，每次间隔1分钟；
3) 将取出拉杆的注射器筒（3ml）装在纯化柱上，加入上述DNA与树脂混合液，然后装上拉杆，慢
慢将混合液推进纯化柱内；
4) 卸下注射器筒，拔出拉杆，再将注射器筒装上纯化柱，加2ml 80%的Isopropanol（异丙醇）, 然
后装上拉杆，慢慢推出液体以清洗柱子；
5) 再次卸下注射器筒，将纯化柱装在1.5ml离心管上，10000g离心2 min，以干燥树脂；
6) 再将纯化柱装在一个新的1.5ml离心管上，加30-50μl水或TE缓冲液，1分钟后，10000g离
心20秒，溶出DNA片段；
7) 移去纯化柱，将纯化出的DNA溶液取出部分用于酶切，其余在-20℃下保存备用。 酶切：
1) （每两大组12人）在灭菌的 Eppendorf 管中加入制备的pBluescript KS空载体0.7µg，2 µl 10
×酶切缓冲液，HindIII & BamHI酶各1µl（各5单位），用无菌双蒸水加至20µl 反应体系，于37℃保温1h；
2) （每小组2人）在另一管中加入待插入的DNA片段（纯化的PCR产物）0.3µg（根据实验用量而
定），2µl 10×酶切缓冲液，HindIII 和 BamHI酶各1µl（各5单位），用无菌双蒸水加至20µl 反应体系，于3 7℃保温 1-3 h ；
3) 将上述两管酶解液，每管中加入2倍体积（40µl）的无水乙醇以及1/10体积（2µl）的3M
NaAC(pH=5.2)，置-20℃冰箱 30 min。12,000rpm 4℃ 离心10 min，弃上清，加入100µl 70％乙醇(洗涤沉淀物)，12,000rpm 离心5 min弃上清，室温干燥DNA沉淀 15分钟左右，加入 10 µl 水溶解DNA；
4) 完毕后上述两管各取2µl DNA分别点在parafilm上,再各自加入4µl的3*上样缓冲液及6µl水
（总体积12µl）做0.8%琼脂糖凝胶电泳分析，进行初步定量（同时还可以观察载体的酶切结果）。 连接：
按载体：待插入DNA片段＝1：2（摩尔）的比例混合于一管中，对于本实验来说，载体可用50ng，插入片段50ng，然后加入T4 DNA连接酶缓冲液1µl，最后加T4噬菌体DNA连接酶1µl(5单位)，加水补足（一般掌握在）总体积10 µl，于16℃保温 14～16h（过夜）。
